張榕 毛莉莉 楊少民 劉子蔚 周翠銣 胡秋根

1 南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）放射科，佛山528308；2 南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院附屬陳村醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院附屬陳村醫(yī)院）口腔科，佛山 528313；3 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)樂從醫(yī)院），佛山 528315

肺癌是全球性公共衛(wèi)生問題。2020 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居于第2 位，然而其病死率居于第1 位[1]。近年來(lái)，隨著肺癌基因組學(xué)的不斷發(fā)展，肺癌的治療取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但是對(duì)早期肺癌的篩查、管理、治療等仍未達(dá)到共識(shí)[2]。早期肺腺癌以磨玻璃樣密度為主，高分辨率CT（high resolution CT，HRCT）可對(duì)其進(jìn)行薄層掃描及多平面重建，具有良好的靈敏度和特異度[3]。多種肺癌相關(guān)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢查指標(biāo)的表達(dá)對(duì)評(píng)估肺癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)行為有一定的價(jià)值，其臨床組織病理學(xué)特征與肺腺癌的病理分期、分化程度、指導(dǎo)預(yù)后、輔助診斷和治療等息息相關(guān)。目前未見同時(shí)檢測(cè)多種IHC 蛋白表達(dá)與肺磨玻璃結(jié)節(jié)（ground-glass nodule，GGN）影像特征相關(guān)性的報(bào)道，因此，本研究旨在探討肺GGN 的HRCT 影像特征與IHC 檢查指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床醫(yī)師早期診斷肺GGN 及評(píng)估其浸潤(rùn)性提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年1 月至2020 年5 月于南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）經(jīng)手術(shù)和組織病理學(xué)檢查結(jié)果確診的144 例肺GGN患者的臨床資料，其中男性46 例、女性98 例，年齡28～80（51.9±11.9）歲。所有患者均行手術(shù)及IHC檢查，根據(jù)2021 年世界衛(wèi)生組織肺腫瘤組織新分類方法[4]，將144 例肺GGN 患者分為3 組：浸潤(rùn)前病變（pre-invasive lesion，PI）組35 例、微浸潤(rùn)性腺癌（microinvasive adenocarcinoma，MIA）組46 例和浸潤(rùn)性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）組63例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有完整的影像資料、組織病理學(xué)檢查資料及臨床資料；（2）肺GGN 手術(shù)切除前已做胸部HRCT 檢查；（3）組織病理學(xué)檢查結(jié)果診斷為肺GGN；（4）無(wú)其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）CT 圖像存在嚴(yán)重偽影；（2）術(shù)前接受過(guò)肺GGN 的腫瘤相關(guān)治療（如靶向治療、放化療等）。本研究獲得南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：KYLS20220710），且所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 檢查方法

使用德國(guó)西門子公司Somatom Definition AS 128 層螺旋CT 機(jī)。掃描上下范圍由肺尖到膈面，左右范圍包括兩側(cè)腋窩及胸壁。掃描參數(shù)：視野300 mm×300 mm、管電流200 mA、管電壓120 kV、螺距1.2、準(zhǔn)直寬64×0.625 mm、掃描時(shí)間5～7 s、重建層厚0.6 mm、矩陣512×512。由2 位高年資胸部放射科診斷主任醫(yī)師使用盲法閱片，意見不一致時(shí)與第3 位高年資胸部放射科診斷主任醫(yī)師協(xié)商達(dá)成一致。GGN 的長(zhǎng)徑和平均密度精確到小數(shù)點(diǎn)后2 位數(shù)，每個(gè)樣本測(cè)量3 次并取其平均值。GGN 的7 種CT 形態(tài)特征記錄為“有”或“無(wú)”，若結(jié)果難以判斷，則記錄為“無(wú)”。選擇分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界、微血管穿行征、空泡征和空氣支氣管征7 種CT 特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 IHC 切片處理

所有IHC 切片均從病理科獲得。在掃描儀（型號(hào)：Pannoramic MIDI，廠家：匈牙利3D HISTECH）的鏡頭下移動(dòng)IHC 切片。將IHC 切片上所有的染色點(diǎn)用Pannoramic viewer 軟件打開，以1～400 倍任意倍數(shù)放大后進(jìn)行觀察，并截取圖片。用Quant center 分析軟件自動(dòng)識(shí)別相應(yīng)細(xì)胞，并設(shè)置IHC 切片上所有的深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性、棕黃色為中度陽(yáng)性、淺黃色為弱陽(yáng)性、藍(lán)色為陰性，進(jìn)而使用Image J 1.8.0 軟件對(duì)每個(gè)染色點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別并分析IHC 檢查指標(biāo)[細(xì)胞增殖核抗原Ki-67（簡(jiǎn)稱Ki-67）、p53、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、p40、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyriod transcription factor-1，TTF-1）、細(xì) 胞 角 蛋 白7（cytokeratin 7，CK7）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、CK5/6、新天冬氨酸蛋白酶A（noval asparticproteinase of pepsin family A，Napsin A）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）]的相對(duì)表達(dá)水平（單位：像素）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制ROC 曲線。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以例（百分比）表示，組間比較采用方差分析或χ2檢驗(yàn)。采用單因素及多因素Logistic 回歸模型分析影響因素并建立預(yù)測(cè)模型：模型Ⅰ（MIA組，參考組為PI 組）；模型Ⅱ（IA 組，參考組為PI 組）；模型Ⅲ（MIA 組，參考組為IA 組），并繪制ROC 曲線，獲得最佳診斷臨界值，分析該模型的診斷效能。采用χ2檢驗(yàn)分析HRCT 影像特征與IHC 檢查指標(biāo)表達(dá)水平的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組肺GGN 患者的影像特征差異分析

圖1 分別列舉了3 組中3 例肺GGN 患者的HRCT 影像特征和組織病理學(xué)檢查圖。組間單因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，除了空泡征（F=5.758，P=0.218），其余影像特征（GGN 長(zhǎng)徑、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界、微血管穿行征、空氣支氣管征）在3 組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.952～82.901，均P＜0.05）（表1）。

表1 3 組肺GGN 患者的單因素Logistic 回歸分析結(jié)果Table 1 Results of univariate Logistics regression analysis among three groups of patients with pulmonary ground-glass nodules

圖1 3 例肺GGN 患者（女性，55 歲、42 歲；男性，39 歲）的高分辨率CT 橫斷面圖（A、C、E）及組織病理學(xué)檢查圖（B、D、F）（蘇木精-伊紅染色，×400） A 顯示右肺尖可見一圓形純GGN，大小為7 mm×7 mm，CT 值約為-571.3 HU，瘤-肺邊界清晰（紅色箭頭）；B 顯示為PI；C 顯示左肺上葉舌段見一類圓形純GGN，大小為7 mm×5 mm，CT 值約為-489.5 HU，瘤-肺邊界清晰（紅色箭頭），邊緣可見微血管穿行（黃色箭頭）；D 顯示為MIA，支氣管及脈管殘端未見腫瘤組織；E 顯示右肺下葉內(nèi)側(cè)基底端見一混合GGN，大小為9 mm×6 mm，CT 值約為-520.2 HU，病灶周圍葉間胸膜及側(cè)胸膜牽拉、凹陷（綠色箭頭），可見微血管向病灶中間穿行（黃色箭頭），病灶內(nèi)部可見空泡影（藍(lán)色箭頭）；F 顯示為IA，附壁生長(zhǎng)為主。GGN 為磨玻璃結(jié)節(jié)；CT 為計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)；PI 為浸潤(rùn)前病變；MIA 為微浸潤(rùn)性腺癌；IA 為浸潤(rùn)性腺癌Figure 1 High resolution CT transverse images (A, C, E) and histopathological examination images (B, D, F) of 3 patients (female, 55 years old, 42 years old; male, 39 years old) with pulmonary ground-glass nodules

3 組肺GGN 患者多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，模型的-2 對(duì)數(shù)擬然值為130.685，擬合自由度為18（χ2=177.47，P＜0.05），所建模型有效且只有GGN 長(zhǎng)徑可作為評(píng)估3 組肺GGN 浸潤(rùn)性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（B=0.628、0.894、-0.265，均P＜0.05）（表2）。模型Ⅰ、模型Ⅱ、模型Ⅲ ROC 曲線的AUC分別為0.870、0.860、0.976，靈敏度分別為85.7%、84.8%、85.7%，特異度分別為73.9%、79.4%、98.4%，最佳診斷臨界值分別為6.5、10.0、6.5。當(dāng)GGN 長(zhǎng)徑＜6 mm 時(shí)，傾向于PI；當(dāng)6 mm≤GGN長(zhǎng)徑≤10 mm 時(shí)，傾向于MIA；當(dāng)GGN 長(zhǎng)徑＞10 mm 時(shí)，傾向于IA（圖2）。

圖2 Logistic 回歸模型評(píng)估GGN 長(zhǎng)徑對(duì)3 組肺GGN 患者的診斷效能受試者工作特征曲線 A、B、C 分別為模型Ⅰ、模型Ⅱ、模型Ⅲ受試者工作特征曲線。GGN 為磨玻璃結(jié)節(jié)；模型Ⅰ為微浸潤(rùn)性腺癌，參考組為浸潤(rùn)前病變；模型Ⅱ?yàn)榻?rùn)性腺癌，參考組為浸潤(rùn)前病變；模型Ⅲ為微浸潤(rùn)性腺癌，參考組為浸潤(rùn)性腺癌Figure 2 Evaluation of diagnostic efficacy of ground-glass nodules diameter in three groups of pulmonary ground-glass nodules patients by Logistic regression model receiver operator characteristic curves

表2 3 組肺GGN 患者的多因素Logistic 回歸分析結(jié)果Table 2 Results of multivariate Logistic regression analysis in three groups of patients with pulmonary ground-glass nodules

2.2 HRCT 影像特征與VEGF、p53 和Ki-67 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

以肺GGN浸潤(rùn)的程度為狀態(tài)變量，IHC 檢查指標(biāo)為檢驗(yàn)變量進(jìn)行ROC 分析（圖3），結(jié)果顯示，Ki-67、p53 和VEGF 對(duì)肺GGN 浸潤(rùn)程度具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，其AUC 分別為0.760、0.773 和0.829，靈敏度分別為69.8%、66.7%和76.2%，特異度分別為76.5%、81.5 和75.3%，其他IHC 檢查指標(biāo)對(duì)應(yīng)的AUC 均＜0.700。因此，Ki-67、p53 和VEGF 對(duì)IA 有著較高的診斷價(jià)值，其最佳診斷臨界值分別為3.9、3.8 和3.9。

圖3 免疫組織化學(xué)檢查指標(biāo)評(píng)估肺GGN 浸潤(rùn)程度的受試者工作特征曲線 GGN 為磨玻璃結(jié)節(jié)；Ki-67 為細(xì)胞增殖核抗原；p53 為抑癌基因53；VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；p40 為抑癌基因40；TTF-1 為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1；CK7 為細(xì)胞角蛋白7；EGFR 為表皮生長(zhǎng)因子受體；CK5/6 為細(xì)胞角蛋白5/6；Napsin A 為新天冬氨酸蛋白酶A；CEA 為癌胚抗原Figure 3 Receiver operator characteristic curves of immunohistochemical examination indexes for evaluating the invasion degree of pulmonary ground-glass nodules

以最佳診斷臨界值區(qū)分VEGF、p53 及Ki-67表達(dá)水平的高低，并分析HRCT 影像特征與VEGF、p53 及Ki-67 表達(dá)水平的相關(guān)性，由表3 可知，GGN 長(zhǎng)徑＞10 mm、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界與VEGF、p53、Ki-67 的高表達(dá)水平具有相關(guān)性（χ2=13.582～41.351，均P＜0.05）；微血管穿行征與Ki-67 的高表達(dá)水平具有相關(guān)性，而與VEGF、p53 的低表達(dá)水平具有相關(guān)性（χ2=15.111、15.644、16.121，均P＜0.05）；空泡征、空氣支氣管陽(yáng)性與Ki-67、p53及VEGF 的表達(dá)水平均無(wú)相關(guān)性（χ2=4.825～24.651，均P＞0.05）。

表3 高分辨率CT 影像特征與VEGF、p53 和Ki-67 表達(dá)水平的相關(guān)性（例）Table 3 Correlation between high resolution CT images features and expression level of vascular endothelial growth factor, p53 and Ki-67 (case)

3 討論

近年來(lái)，隨著HRCT 的廣泛應(yīng)用，肺GGN 的檢出率明顯提高[5-6]。隨著病程的進(jìn)展，肺GGN 可表現(xiàn)出一些以組織病理學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的影像特征。IHC 檢查指標(biāo)的表達(dá)水平對(duì)肺癌的診斷、分類和治療具有重要的作用，通過(guò)探討HRCT 影像特征與IHC 檢查指標(biāo)表達(dá)水平的相關(guān)性，可為肺GGN 的臨床診斷、治療及預(yù)后提供有價(jià)值的方案。

既往多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，可根據(jù)GGN 長(zhǎng)徑、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、空泡征、空氣支氣管征等形態(tài)學(xué)特征區(qū)分GGN 的良惡性[7-9]。本研究結(jié)果顯示，GGN 長(zhǎng)徑、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界、微血管穿行征及空氣支氣管征的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與上述研究結(jié)果一致，然而空泡征組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？张菡鞯慕M織病理學(xué)基礎(chǔ)是未被腫瘤侵犯的含氣肺組織、未封閉的細(xì)支氣管或沿肺泡壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞、未封閉的肺泡腔，而本研究的研究對(duì)象為早期肺腺癌GGN，其主要形態(tài)為附壁生長(zhǎng)未封閉管腔。因此，空泡征的組間差異在本研究中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

隨著腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)性不斷增強(qiáng)，其增殖能力相應(yīng)提高，并向不同方向生長(zhǎng)，GGN 也逐漸出現(xiàn)分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征等形態(tài)學(xué)特征，腫瘤細(xì)胞需要的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相應(yīng)增多，促使微血管形成。本研究多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界、微血管穿行征及空氣支氣管征不是評(píng)估3 組肺GGN浸潤(rùn)性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究者也提出，毛刺征、分葉征和胸膜牽拉征不足以作為預(yù)測(cè)肺GGN良惡性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-12]。肺GGN 中微血管穿行征的發(fā)生率與其長(zhǎng)徑和胸膜距離有關(guān)，與浸潤(rùn)性無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，因此微血管穿行征不能作為預(yù)測(cè)肺GGN 浸潤(rùn)性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]，這與本研究結(jié)果一致。在肺癌的TNM 分期中，T 分期根據(jù)腫瘤長(zhǎng)徑進(jìn)行評(píng)估，肺GGN 長(zhǎng)徑一直被認(rèn)為是評(píng)估肺癌浸潤(rùn)程度的重要參考因子[13]，本研究結(jié)果顯示，GGN 長(zhǎng)徑是評(píng)估3 組肺GGN 患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與上述研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果顯示，GGN 長(zhǎng)徑為10 mm 是評(píng)估肺腺癌良惡性的最佳臨界值[13-14]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)GGN 長(zhǎng)徑＜6 mm時(shí)，傾向于PI；當(dāng)6 mm≤GGN 長(zhǎng)徑≤10 mm 時(shí)，傾向于MIA；當(dāng)GGN 長(zhǎng)徑＞10 mm 時(shí)，傾向于IA。因此本研究結(jié)果對(duì)評(píng)估肺GGN 的浸潤(rùn)性具有更好的診斷價(jià)值，更有利于臨床對(duì)肺GGN 的管理、診斷及治療。

Ki-67 是一種重要的腫瘤細(xì)胞增殖生物標(biāo)志物，在細(xì)胞增殖周期（G1、S、G2 期和M 期）中過(guò)表達(dá)，但在G0 期細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[15]，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[16]，隨著GGN 浸潤(rùn)程度的增加，Ki-67 的表達(dá)水平也相應(yīng)升高[17]。p53為抑癌基因，通過(guò)激活大量的效應(yīng)通路來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生，其發(fā)生基因突變后轉(zhuǎn)化為癌基因，隨著GGN 浸潤(rùn)程度的增加，p53 的表達(dá)水平也相應(yīng)升高[18]。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移需要充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其血管生成依賴于腫瘤細(xì)胞間的相互作用等高度復(fù)雜的機(jī)制[19]。VEGF 是促血管生成的最關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，其與肺GGN 的侵襲性相關(guān)，隨著肺GGN浸潤(rùn)程度的增加，VEGF 的表達(dá)水平相應(yīng)升高[20-21]。有研究結(jié)果表明，不同浸潤(rùn)程度的肺GGN 影像特征與VEGF 表達(dá)水平具有相關(guān)性[21-22]。我們進(jìn)一步分析肺GGN 的HRCT 影像特征與VEGF、p53 及Ki-67 表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，GGN 長(zhǎng)徑＞10 mm、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征和瘤-肺邊界與VEGF、p53 和Ki-67 的高表達(dá)水平具有相關(guān)性，這表明隨著腫瘤體積逐漸增大，腫瘤細(xì)胞微血管生成速度較快，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，需要大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促使腫瘤周圍組織血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而對(duì)周圍肺組織也產(chǎn)生間質(zhì)性改變；微血管穿行征與Ki-67 的高表達(dá)和VEGF、p53 的低表達(dá)水平具有相關(guān)性，這可能由于本研究的研究對(duì)象為肺GGN，其存在惰性生物學(xué)行為，雖然腫瘤細(xì)胞在增殖，但是其增殖能力及浸潤(rùn)程度比較弱?？张菡鳌⒖諝庵夤苷髋cKi-67、p53 和VEGF 的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性，這可能與早期肺腺癌組織主要為附壁生長(zhǎng)有關(guān)。也有文獻(xiàn)報(bào)道，空泡征、空氣支氣管征在PI 和IA 中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。綜上，肺GGN 長(zhǎng)徑＞10 mm、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界與VEGF、p53 和Ki-67高表達(dá)具有相關(guān)性；微血管穿行征與Ki-67 高表達(dá)具有相關(guān)性，而與VEGF 及p53 低表達(dá)具有相關(guān)性；空泡征、空氣支氣管征與VEGF、p53 和Ki-67 的表達(dá)無(wú)相關(guān)性。

本研究的局限性：（1）病例數(shù)較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行前瞻性隊(duì)列分析；（2）影像醫(yī)師和病理醫(yī)師的評(píng)估具有差異性；（3）未對(duì)納入患者的性別和年齡等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分層分析。

綜上所述，肺GGN 長(zhǎng)徑是評(píng)估其浸潤(rùn)程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具有較好的診斷效能。HRCT 影像特征與Ki-67、VEGF 和p53 的表達(dá)水平具有相關(guān)性，二者綜合分析可以有效評(píng)估肺GGN 的病理分型、腫瘤細(xì)胞的增殖活性及浸潤(rùn)程度，為臨床管理肺GGN、選擇合適的治療方案提供參考。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明張榕負(fù)責(zé)資料的收集、研究方法的設(shè)計(jì)、圖像的分析、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析、論文的撰寫；毛莉莉負(fù)責(zé)研究方法的設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析；楊少民負(fù)責(zé)圖像的分析、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、論文的審閱與修改；劉子蔚、周翠銣負(fù)責(zé)圖像的分析、文獻(xiàn)的搜集、論文的修改；胡秋根負(fù)責(zé)論文的修改與最終版本的修訂