鐘 巍 周俊輝 高 潔 房 芳 劉曉樂 張娜娜 孟憲慧

胸腔鏡肺癌根治術中常用的單肺通氣(OLV)是一種非生理性呼吸模式，可導致低氧血癥、肺損傷甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，增加術后肺部并發(fā)癥(PPC)的發(fā)生，影響患者臨床預后。非通氣側肺萎陷和復張引起的缺血-再灌注損傷，以及OLV期間機械通氣引起的氧化應激反應，可造成明顯的肺損傷[1]。肺泡巨噬細胞(AM)是ARDS及肺損傷的重要效應細胞，在肺部炎癥反應及組織修復中具有重要作用[2]。有研究[3]結果表明，OLV后對非通氣側肺進行持續(xù)給氧可改善食管切除術OLV結束后肺的氧合功能，減輕全身和非通氣側肺的炎癥和氧化應激反應。然而，OLV時非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧減輕胸腔鏡下肺癌根治術患者非通氣側肺損傷的機制尚有待進一步研究。本研究擬探討非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧是否可通過調節(jié)AM分化及其功能減輕胸腔鏡下肺癌根治術老年患者非通氣側肺損傷。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年12月20日—2019年9月5日在河南省胸科醫(yī)院擇期行胸腔鏡下肺癌根治術的老年患者60例，其中男33例，女27例，年齡65～80歲，體重45～85 kg，身高145～185 cm。符合ASA分級Ⅱ或Ⅲ級。排除標準：嚴重的肺部疾??；左心室射血分數(shù)<40%；腎功能不全；癡呆、帕金森病、腦卒中、吸毒或長期服用精神類藥物；嚴重的心臟傳導阻滯、高血壓、冠心病和糖尿?。恍g前語言交流及認知功能障礙；長期服用類固醇藥物、激素類藥物；近期有重大手術史。剔除標準：圍手術期發(fā)生不良事件，如出血量>600 mL；圍手術期感染；麻醉時間>5 h；再次手術。采用隨機數(shù)字表法將納入患者分成研究組和對照組，每組30例。本研究方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核、批準(審批號：2018-03-012)，術前已征得患者及其委托人的同意與授權，并簽署知情同意書。

1.2 麻醉方法 所有患者術前常規(guī)禁飲、禁食，入手術室后常規(guī)監(jiān)測心電圖、血壓及經皮動脈血氧飽和度(SpO2)。開放上肢外周靜脈通道，輸注乳酸鈉林格液6～8 mL/kg。局部麻醉(簡稱局麻)下行橈動脈穿刺置管并監(jiān)測動脈壓。全身麻醉(簡稱全麻)誘導采用丙泊酚1.5～2.0 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和羅庫溴銨0.6 mg/kg靜脈注射，選擇大小合適的可視化雙腔支氣管導管進行氣管內插管。插管后分別于仰臥位及側臥位，通過可視化鏡頭檢查氣管導管的位置正確與否。麻醉誘導完成后行右側頸內靜脈穿刺置管。麻醉維持采用全憑靜脈麻醉，靜脈泵注丙泊酚4～8 mg/(kg·h)、瑞芬太尼0.05～0.2 μg/(kg·h)、右美托咪定0.2～0.7 μg/(kg·h)及羅庫溴銨0.3～0.6 mg/(kg·h)進行麻醉維持。術中通過調控麻醉深度使腦電雙頻指數(shù)(BIS)維持于40～60。雙肺通氣時，以潮氣量6～8 mL/kg進行通氣，OLV時，以潮氣量4～5 mL/kg進行保護性OLV。術中呼氣末正壓由麻醉醫(yī)師判斷選擇。OLV時以空-氧混合通氣調節(jié)FiO2，以維持SpO2≥92%。人工記錄術中呼吸頻率、呼氣末正壓和FiO2。按照常規(guī)，若患者術中發(fā)生低氧血癥(SpO2<90%)，則進行肺復張。術中平衡晶體液滴速為3 mL/(kg·h)。術畢前15 min靜脈注射羥考酮0.1 mg/kg，縫皮前給予0.25%羅哌卡因切口皮下注射。手術結束時，應用4個成串刺激(TOF)評估神經肌肉組織中是否殘留肌肉松弛藥，若TOF監(jiān)測值≥0.9，予可拔除氣管導管；若TOF監(jiān)測值<0.9，則使用舒更葡糖4 mg/kg進行拮抗，待TOF恢復至0.9時在手術室內拔除氣管導管。患者術后均送入麻醉后恢復室(PACU)，連接電子止痛泵行頸靜脈患者自控鎮(zhèn)痛(PCIA)。

1.3 干預措施 OLV后研究組從非通氣側肺置入14 F導管于氣管隆嵴分叉后2～3 cm，并給予1～4 L/min的持續(xù)性中-低流量給氧；對照組非通氣側肺不給予持續(xù)性中-低流量給氧，只在氣管隆嵴分叉后2～3 cm置入14 F導管。

1.4 檢測項目

1.4.1 血氣分析 于麻醉誘導后即刻(T0)和OLV后30 min (T1)、1 h (T2)及2 h (T3)時采集橈動脈血，應用GEM Premier 3000血氣分析儀(美國力康公司)進行血氣分析。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)采集 T3時在可視化雙腔支氣管導管的大、小套囊均鼓起的情況下對非通氣側肺進行BALF采集，由熟練操作纖維支氣管鏡的醫(yī)師完成。選用BF-1T260型電子支氣管鏡(日本Olympus公司)，將其末端與兩組患側肺中葉或舌葉的葉支氣管開口處緊密契合，緩慢注入37 ℃的醫(yī)用0.9%氯化鈉(NaCl)溶液，灌注后用50～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)負壓吸引緩慢回收，回收率≥40%為回收成功，每次灌洗量為40 mL，共3次，總量為200 mL，BALF經雙層無菌紗布過濾，4 ℃冷卻10 min，再以3 000 r/min的轉速(離心半徑15 cm)離心15 min，留取上清液，置于-20 ℃以備后續(xù)檢測用。

1.4.3 肺組織學評價 T3時切取已切除的肺癌外周的正常肺組織，置于4%中性甲醛溶液中固定、石蠟包埋、組織切片、H-E染色，并由對研究方案和分組不知情的病理科醫(yī)師進行肺損傷評分[4]。

1.4.4 AM分選 利用Alex Fluor標記的CD11b抗體、PE-Cy7標記的Siglec F抗體和APC標記的CD11c抗體(美國Santa Cruz生物科技公司)標記人AM (CD11b-CD11c+Siglec F+)。從離心后的BALF上清液中收集細胞并制成細胞懸液，加入抗體，避光冰浴30 min，向離心管中加入1 mL流式緩沖液終止染色，迅速離心去除上清液，將細胞用200 μL流式緩沖液重懸，細胞濾網過濾后，使用MoFlo Astrios EQ流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)進行流式細胞分選。

1.4.5 AM凋亡檢測 按試劑盒說明書進行操作，將分選出的AM與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)孵育，流式細胞術分析AM中的凋亡細胞比例。

1.4.6 AM表型檢測 為判斷AM的分化狀態(tài)，使用美國Sigma公司的雙抗體夾心法ELISA試劑盒，檢測研究組和對照組離心后的BALF上清液中M1型AM標志物[誘導性一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-6]和M2型AM標志物[精氨酸酶1(Arg1)、IL-10]的水平。

1.4.7 活性氧(ROS)的測定 按試劑盒(美國Enzo Biochem公司)說明書進行操作，將分選出的AM細胞懸液與 DCFH-DA 熒光探針(10 μmol/L)混勻、孵育，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞，經流式細胞儀檢測，以前向散射(FS)和側向散射(SS)，指示細胞光透射程度為參數(shù)，選取活細胞(大 FS 值，較小 SS 值)圈門，對門內的細胞進行ROS分析。以探針熒光讀數(shù)的對數(shù)為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標即為測定細胞內ROS水平的相對值。

1.4.8 Ca2+濃度的檢測 按試劑盒(美國Enzo Biochem公司)說明書進行操作，將分選出的AM細胞懸液與Fluo4-AM工作液(濃度為2 μmol/L)混勻、孵育。通過流式細胞儀檢測細胞內Ca2+濃度相對值。

2 結 果

2.1 兩組患者一般和臨床資料的比較 兩組患者年齡、BMI、性別構成、ASA分級構成、術前FEV1/用力肺活量(FVC)、雙肺通氣時間、paO2、paCO2、OLV時間、手術時間、麻醉時間、術中失血量和輸入液體量的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表1。

A 對照組 B 研究組圖1 兩組患者肺組織病理學結果(H-E染色，×200)

表1 兩組患者一般和臨床資料的比較 (N=30)

2.2 兩組患者不同時間點血氣分析結果比較 與同組T0時比較，T1～T3時兩組paO2均顯著下降(P值均<0.05)，paCO2均顯著升高(P值均<0.05)。T1～T3時研究組paO2均顯著高于對照組(P值均<0.05)，paCO2均顯著低于對照組(P值均<0.05)。見表2。

2.3 兩組患者肺組織病理學結果 對照組T3時，術側正常肺組織肺泡壁增厚、水腫，可見大量中性粒細胞和單核細胞，肺泡腔內可見較多炎性滲出液；肺間質明顯增厚，可見大量炎癥細胞浸潤。研究組肺泡間隔增寬，毛細血管未見明顯充血，小部分肺泡腔可見紅細胞及炎性滲出液；肺間質炎癥細胞浸潤明顯少于對照組。見圖1。

2.4 兩組患者肺損傷評分及AM凋亡率的比較 T3時，研究組肺損傷評分顯著低于對照組(P<0.05)；研究組AM活細胞率顯著高于對照組(P<0.05)，AM早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著低于對照組(P值均<0.05)。見表3。

2.5 兩組BALF中M1型和M2型AM標志物的比較 研究組BALF中iNOS、IL-6和TNF-α水平均顯著低于對照組，而Arg-1和IL-10水平均顯著高于對照組(P值均<0.05)。見表4。

表3 兩組患者T3時肺損傷評分及AM凋亡率的比較

表4 兩組BALF中M1型和M2型AM標志物的比較

2.6 兩組BALF中AM內Ca2+濃度和ROS水平的比較 研究組BALF中AM內的Ca2+濃度相對值顯著高于對照組(10.81±2.83比7.64±2.31)，而ROS水平顯著低于對照組(407±12比812±19，P值均<0.05)。

3 討 論

OLV期間因機械通氣不足引起的肺不張、氧合功能下降、炎癥反應和肺損傷等，均可導致患者肺的病理生理學變化[5]。OLV時非通氣側肺雖不參與氧合作用，但仍然有血液供應，肺內分流率(Qs/Qt)值增加[6]。低氧血癥是影響患者生理功能的最重要因素，是造成術中和術后嚴重并發(fā)癥的主要原因[7]。當FiO2和血流動力學等指標相同時，OLV時肺泡-動脈氧分壓差(A-aDO2)較雙肺通氣時更大，且paO2較雙肺通氣時更低。本研究結果表明，兩組患者在OLV后出現(xiàn)不同程度的氧合功能下降，而OLV期間予非通氣側肺持續(xù)性中-低流量給氧則可改善OLV后肺的氧合，有效減少OLV后低氧血癥的發(fā)生，對肺組織起到有效的保護作用。

據報道，通過纖維支氣管鏡以5 L/min的氧流量對非通氣側的肺部進行選擇性供氧，可顯著改善氧合，但不影響手術操作[8]。研究[9]結果表明，以5 L/min的氧流量進行的非通氣側肺持續(xù)給氧可以改善OLV期間的動脈氧合功能，并降低Qs/Qt，同時可將肺塌陷保持在最令手術醫(yī)師滿意的程度。本研究結果顯示，研究組肺損傷評分顯著低于對照組，提示術中非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧可減輕非通氣側肺損傷，這可能與其改善患者氧合功能有關。研究[10]結果表明，OLV誘發(fā)肺損傷的機制非常復雜，包括機械通氣、低氧血癥和氧化應激反應。本研究結果顯示，OLV期間予非通氣側肺持續(xù)性中-低流量給氧，可減少低氧血癥的發(fā)生，故其對OLV誘發(fā)的肺損傷亦有一定的減輕作用。

AM一般分為兩種形態(tài)，即M1型巨噬細胞(CAM)和M2型巨噬細胞(AAM)。這兩種形態(tài)是AM分化后兩種極端對立的狀態(tài)，在具體的肺部微環(huán)境中，AM各種表型之間并無明顯界限，且根據局部微環(huán)境的變化不斷進行著表型間的轉換，維系一種微妙的平衡[11]。在機械通氣的外源性刺激下，肺泡受損后分泌的炎癥介質刺激AM，打破了這種平衡。本研究結果表明，與對照組比較，研究組AM釋放大量的M1型和M2型標志物，細胞凋亡率顯著增高，提示肺損傷時AM發(fā)生了異常的活化和分化。與對照組相比，研究組AM M1型標志物減少，M2型標志物增加，提示非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧對AM分化產生一定的影響，有效減少了CAM產生，增加AAM的產生。

急性肺損傷的過程中，AM通過分泌大量的氧化物參與免疫應激反應。在外界環(huán)境的刺激下，AM內的iNOS與Arg-1競爭性的結合底物精氨酸，分解成不同的產物。精氨酸與iNOS結合后，分解成瓜氨酸與NO。NO與超氧化物歧化酶(SOD)競爭性的結合細胞代謝過程中的ROS形成氧化劑與亞硝酸鹽，使得肺泡上皮細胞通透性增加，從而導致急性肺損傷。而Arg-1與精氨酸結合后可分解為多胺和脯氨酸，促進了細胞分裂與膠原的形成，在炎癥末期起到組織修復的作用[12]。本研究結果顯示，與對照組相比，研究組iNOS、ROS水平均顯著降低，而Arg-1水平顯著增高，提示非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧能夠通過改變AM內氧化物的水平，減輕急性肺損傷。

一磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)是重要的細胞代謝感受器，在炎癥反應中起抑制作用，同時促進抗炎性的巨噬細胞極化[13]。AMPK促進巨噬細胞的M2型極化的途徑較多，包括抑制 NF-κB和激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-δ、蛋白激酶B(Akt)等。而AMPK的激活需要鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)的調節(jié)，在肺組織損傷時，外源性Ca2+進入AM內，造成Ca2+超載。Ca2+與CaMKKβ結合誘導的相關級聯(lián)反應使AMPK活化，進而使Janus激酶(JAK)2激活并催化酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，這些磷酸化的酪氨酸位點與STAT3結合并催化STAT3磷酸化，誘導AM向AAM轉變；活化的AMPK抑制NF-κB激活，減弱AM向CAM轉變[14]。本研究結果表明，研究組AM內的Ca2+濃度顯著高于對照組，提示非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧可促進AM內Ca2+濃度升高，從而可能誘導AM向AAM轉變，抑制AM向CAM轉變。

綜上，老年患者胸腔鏡下肺癌根治術中非通氣側肺持續(xù)中-低流量給氧可調節(jié)異常AM的表型與功能，抑制AM凋亡，減輕非通氣側肺損傷。