顏驪穎 張亞培 董世雷,*

(1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，杭州 310053；2 浙江醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，杭州 310013)

能量依賴型蛋白酶或蛋白酶復(fù)合物是細(xì)胞中最常見的蛋白降解系統(tǒng)，在其對蛋白降解的過程中，通常依靠AAA+超家族(ATPases associated with various cellular activities)中的ATP酶(ATPase)水解ATP提供能量[1]。在AAA+超家族蛋白中至少存在10種不同類型的ATP酶(ClpA，ClpB，ClpC，ClpD，ClpE，ClpL，ClpM，ClpN，ClpX和ClpY)[2-3]，它們可被分為兩類：一類分子量較大，含有兩個典型ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如ClpA，ClpB，ClpC，ClpD，ClpE和ClpL；另一類分子量較小，僅含一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如ClpM，ClpN，ClpX和ClpY。到目前為止，發(fā)現(xiàn)ClpA，ClpC，ClpE和ClpX可以與ClpP蛋白酶結(jié)合形成蛋白酶復(fù)合物ClpAP，ClpCP，ClpEP，ClpXP或ClpAPX，而ClpY(又稱HslU)可與ClpQ(又稱HslV)蛋白酶結(jié)合形成蛋白酶復(fù)合物ClpYQ(HslUV)。在ATP酶水解ATP提供能量的前提下，蛋白較容易地被ClpP或ClpQ降解。ClpP和ClpQ均屬于Ntn水解酶超家族(N-terminal nucleophile hydrolase superfamily)，該超家族蛋白通常借助其N-末端的親核氨基酸自催化而活化，即N-末端氨基充當(dāng)質(zhì)子受體激活位于Ser或Thr殘基上的親核性羥基或Cys殘基上的親核性巰基，繼而對底物進(jìn)行親核攻擊，使其水解。

細(xì)菌AAA+蛋白酶在不同細(xì)菌中的分布略有差異，如ClpAP，ClpXP和ClpYQ多分布于革蘭陰性菌中[4-6]，而ClpCP和ClpEP多分布于革蘭陽性菌中[7-10]，如枯草芽胞桿菌、變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。本文將主要討論細(xì)菌ClpP的結(jié)構(gòu)及分子功能、在不同細(xì)菌中的作用以及基于細(xì)菌ClpP的抗菌藥物研發(fā)方面的研究進(jìn)展。

1 細(xì)菌ClpP的結(jié)構(gòu)及分子功能

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的水解與細(xì)胞功能密切相關(guān)。在細(xì)胞中，即使無基因突變和蛋白翻譯錯誤，也有超過三分之一的新合成的蛋白質(zhì)不能正確折疊，其中被正確折疊且有正常功能的蛋白也極易因不利環(huán)境因素如熱休克、滲透壓、氧化應(yīng)激和氧自由基等而受損[11]。當(dāng)這些折疊不完全的、受損的蛋白積累到一定程度后，將會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故蛋白質(zhì)的降解與蛋白質(zhì)的合成同等重要，它們在細(xì)胞生命周期中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在蛋白質(zhì)降解過程中，AAA+超家族中的ATP酶可通過水解ATP提供水解蛋白過程中所需的能量。ClpP是一種絲氨酸蛋白酶，其活性位點位于其桶狀蛋白水解室內(nèi)，當(dāng)它與AAA+超家族ATP酶或Clp/Hsp100分子伴侶(Clp-ATPase)結(jié)合時，可以水解多種類型的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)新陳代謝動態(tài)平衡[12]。

細(xì)菌AAA+ ATPase-ClpP蛋白酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與真核生物26S蛋白酶體相似，由ATP酶(或分子伴侶)和ClpP蛋白酶組合而成，其中ATP酶(如ClpA、ClpC、ClpE和ClpX等)可組成同源多聚體，負(fù)責(zé)蛋白底物的識別和解折疊，決定ClpP蛋白酶的底物特異性，并將底物轉(zhuǎn)運至蛋白酶催化室中降解，在催化室中，ClpP可利用內(nèi)部活性位點將底物降解成多肽小片段。在AAA+ATPase-ClpP蛋白酶復(fù)合物中，ATP酶可自行裝配成同源六聚體，ClpP可寡聚體化后形成內(nèi)部含有14個催化活性位點的同源七聚體，共同組成桶狀蛋白酶復(fù)合物ClpAP、ClpCP、ClpEP、ClpXP或ClpAPX。底物蛋白經(jīng)降解，將被水解為5～10個氨基酸殘基組成的短肽[12]。

ClpP可相互聚集形成由兩個縱向排列的同源七聚體組成的十四聚體型圓柱體，七聚體環(huán)的軸向孔隙是水解室的入口，形成蛋白質(zhì)水解室[13]，如圖1所示，Clp分子伴侶可以結(jié)合在ClpP十四聚體型圓柱體的兩端，在分子伴侶捕獲到折疊不完全的、受損的目標(biāo)蛋白后，在水解ATP提供能量的前提下將底物蛋白去折疊，然后通過七聚體環(huán)的軸向孔隙將去折疊的底物蛋白轉(zhuǎn)移至ClpP水解室內(nèi)，然后將去折疊的底物蛋白水解為小肽段，接著ClpP蛋白分子構(gòu)象改變，打開側(cè)邊赤道面孔道(equatorial side pores)釋放水解產(chǎn)物。

研究表明，缺失N-端前段的10～17個氨基酸后，大腸埃希菌ClpP能夠快速降解去折疊的大分子底物，該降解不依賴于分子伴侶的輔助[15]，提示ClpP軸向孔的開放與ClpP的N-端結(jié)構(gòu)域有關(guān)。因此，沒有ATP酶時，ClpP的N-端區(qū)域必須維持關(guān)閉的狀態(tài)，防止蛋白底物進(jìn)入ClpP的水解室。結(jié)合分子伴侶后，進(jìn)入ClpP水解室的蛋白分子主要由分子伴侶決定，ClpX含有3個重要結(jié)構(gòu)域，依次為：參與底物識別的家族特異性N-端功能結(jié)構(gòu)域、AAA+功能結(jié)構(gòu)域和C-端功能結(jié)構(gòu)域[16]。分子伴侶能誘導(dǎo)ClpP N-端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，有利于大分子去折疊蛋白底物的轉(zhuǎn)移。

據(jù)文獻(xiàn)報道，ClpP具有多個亞型，在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)中，同一操縱子中同時編碼ClpP1和ClpP2兩個亞型的蛋白，這兩種蛋白異構(gòu)體可形成一個由ClpP1和/或ClpP2七聚體環(huán)組成的十四聚體型蛋白酶復(fù)合物[17]。目前，在鉤端螺旋體、銅綠假單胞菌和單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)中也存在兩種ClpP亞型(ClpP1和ClpP2)，而在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中僅發(fā)現(xiàn)一種ClpP，故ClpP在不同細(xì)菌中可能發(fā)揮著不同的作用[17-18]。

2 ClpP在細(xì)菌中的重要作用

ClpP及其相應(yīng)蛋白酶復(fù)合物主要功能是清除或降解細(xì)菌胞內(nèi)合成不當(dāng)、受損傷、變性聚集或無用的蛋白，從而維持細(xì)菌正常代謝和壓力刺激下胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡[19]，ClpP蛋白底物種類較多，目前研究結(jié)果顯示，除參與蛋白質(zhì)代謝外，ClpP還與細(xì)菌藥物敏感性和毒力調(diào)控有關(guān)。

2.1 ClpP在細(xì)菌蛋白質(zhì)代謝中的作用

隨著外界環(huán)境的改變，如溫度變化、氧化損傷和營養(yǎng)限制等，細(xì)菌通常會為適應(yīng)環(huán)境而做出一定的生理和生化改變，這種應(yīng)激反應(yīng)處置能力對其生存是至關(guān)重要的，細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解被廣泛用于調(diào)節(jié)生理過程及清除異常或受損蛋白，在這些調(diào)節(jié)過程中ClpP發(fā)揮著重要作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成過程被意外中斷時，蛋白C末端將會被標(biāo)記上一個含有11個氨基酸的SsrA標(biāo)簽(大腸埃希菌SsrA序列為AANDENYALAA)，隨后被ClpXP或ClpAP識別并降解，防止變性蛋白累積帶來的不利影響[8,20]。在正常生長條件下，大多數(shù)細(xì)菌中的ClpP蛋白處于低水平，當(dāng)環(huán)境改變后，表達(dá)水平將會明顯上調(diào)。在應(yīng)激條件下，DNA修復(fù)蛋白RecN處于高水平，受ClpXP調(diào)控后，可避免其對細(xì)菌的不良影響，直至細(xì)胞回到無壓力狀態(tài)[21-22]。此外，大腸埃希菌中一種重要的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控因子σS，也受到ClpXP所調(diào)控[23]。單核細(xì)胞增多性李斯特菌可編碼兩種不同亞型ClpP，分別為ClpP1和ClpP2[24]，當(dāng)李斯特菌處于熱應(yīng)激(heat stress)條件時，clpP1和clpP2基因表達(dá)水平明顯上調(diào)[25]，提示ClpP1、ClpP2在單核細(xì)胞增生性李斯特菌蛋白質(zhì)降解中起著重要作用。Zhang等[26]構(gòu)建了肺炎鏈球菌的clpP突變株，采用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對其蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)clpP基因缺失后，肺炎鏈球菌胞內(nèi)與一般應(yīng)激反應(yīng)、核苷酸代謝、能量代謝和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化。

2.2 ClpP在細(xì)菌耐藥性中的作用

研究表明，clpP基因突變能使細(xì)菌細(xì)胞壁增厚，增強對溶酶體降解的抵抗力，使細(xì)菌對抗生素的敏感性降低。Mellergaard等[27]從持續(xù)接受達(dá)托霉素治療的患者體內(nèi)分離了5株MRSA(methicillin resistantStaphylococcus aureus)，對其進(jìn)行序列分析后發(fā)現(xiàn)，在治療過程中金黃色葡萄球菌rpoB和clpP等基因發(fā)生了突變，從而導(dǎo)致菌株對達(dá)托霉素產(chǎn)生耐受。在變異鏈球菌(Streptococcus mutans)中，Tian等[28]發(fā)現(xiàn)ΔclpP突變株中MazE和RelB蛋白表達(dá)量明顯增多，該研究結(jié)果提示ClpP蛋白可通過水解調(diào)控MazE和RelB蛋白，增強變異鏈球菌在抗生素壓力下持留菌/生物被膜的形成能力。Zheng等[19]研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌在高濃度利奈唑類或米諾環(huán)素暴露96h后，clpP基因缺失突變株數(shù)量明顯減少，提示ClpP也參與了糞腸球菌的抗生素耐受。上述研究結(jié)果顯示ClpP蛋白可在細(xì)菌耐藥中發(fā)揮一定的作用。

2.3 ClpP在細(xì)菌毒力調(diào)控中的作用

ClpP在致病菌毒性基因調(diào)控和對宿主細(xì)胞致病性方面也發(fā)揮著重要作用。Frees等[29]發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮膚膿腫模型中，與野生株相比，金黃色葡萄球菌ΔclpP突變體毒力明顯下降，該研究結(jié)果證實ClpP對金黃色葡萄球菌毒力的影響是通過調(diào)控毒力因子來實現(xiàn)的，而不是通過提高壓力耐受水平實現(xiàn)。Li等[30]研究表明ClpP蛋白酶在嗜肺軍團(tuán)菌毒力調(diào)控方面也發(fā)揮重要作用。Dickeya dadantiiClpXP可以調(diào)節(jié)III型分泌系統(tǒng)，維持該菌毒力[31]。銅綠假單胞菌ClpXP可以正向調(diào)節(jié)藻朊酸鹽(alginate)的過表達(dá)以及黏液轉(zhuǎn)換(mucoid conversion)，表明ClpP與銅綠假單胞菌的感染有關(guān)[32]。Kwon等[33]研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌ΔclpP突變株不能侵入肺部，在小鼠模型中喪失了在鼻咽中的定植能力，且在小鼠巨噬細(xì)胞中的存活率降低，該研究結(jié)果表明ClpP可以調(diào)節(jié)毒性基因表達(dá)、抵抗宿主攻擊。鼠傷寒沙門菌ClpP對σS的產(chǎn)生及細(xì)菌毒性也有重要影響[34]。單核細(xì)胞增多性李斯特菌ClpP在細(xì)胞黏附、入侵及胞內(nèi)寄生和毒力中發(fā)揮重要作用，且參與感染過程中的細(xì)胞內(nèi)快速適應(yīng)性反應(yīng)[35-36]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)Ail蛋白可賦予該菌體外黏附細(xì)胞、入侵細(xì)胞、抵抗血清攻擊的能力，而該菌ClpP能夠調(diào)節(jié)ail基因的表達(dá)，間接影響該菌毒力[37]。Mtb具有復(fù)雜的應(yīng)急調(diào)控機(jī)制，能夠在各種高壓力環(huán)境中生存下來并保持對宿主的致病性。Mtb的ClpP1、ClpP2蛋白酶復(fù)合物是Mtb所必需的，在感染期間清除受損蛋白方面也發(fā)揮了重要而不可替代的作用，被認(rèn)為是最有潛力的抗Mtb治療藥物靶點[38-39]。總之，ClpP蛋白酶與多種細(xì)菌致病機(jī)理相關(guān)，是新藥物研發(fā)的理想靶標(biāo)之一。

3 基于病原體ClpP的藥物研究

目前，多重耐藥菌對人類健康帶來的威脅越來越大，尋找新型抗菌藥物迫在眉睫。ADEP(acyldepsipeptide，酰基縮肽)是由夏威夷鏈霉菌(Streptomyces hawaiiensis)產(chǎn)生的一種天然化合物，是一類?；念惪股豙40]，ADEP可激活ClpP蛋白酶，致使其蛋白水解功能紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，研究表明，ADEP對PRSP(penicillin resistantStreptococcus pneumoniae)、MRSA和VRE(vancomycin-resistantEnterococcus)等臨床多重耐藥菌均表現(xiàn)出較好的殺菌活性[41-42]。ADEP1(又稱factor A)具有多種同系物，其中常見的6種同系物結(jié)構(gòu)如圖2所示。ADEP通過競爭并取代AAA+ ATPase ClpX與ClpP結(jié)合，導(dǎo)致ClpP蛋白降解功能失控，從而殺滅病原體，Conlon等[43]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)ADEP4與利福平或利奈唑胺聯(lián)合使用時，可有效清除持留菌，而在小鼠中，ADEP4與利福平聯(lián)合使用可以根除金黃色葡萄球菌慢性生物被膜感染。早年研究結(jié)果顯示ADEP1和ADEP2往往僅對革蘭陽性菌具有一定抗菌活性，而對大多革蘭陰性菌不敏感，由于其溶解性差、系統(tǒng)清除快以及藥物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，致使該藥物在小鼠模型中抑菌效果不佳[44]。因ADEP類化合物對革蘭陰性菌療效欠佳，有研究人員對其大環(huán)核心殘基和N-?；鶄?cè)鏈進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了一種新的ADEP衍生物(ADEP-26)，該衍生物不僅對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等革蘭陽性菌顯示出較強的活性，而且對淋病奈瑟球菌和腦膜炎奈瑟球菌也有很強的抑制作用[45]。有研究人員試圖開發(fā)具有抗革蘭陰性菌活性的非ADEP類ClpP靶向化合物，并將其稱為ACPs(activators of self-compartmentalizing proteases)，這些ACPs以類似于ADEP的方式結(jié)合和激活ClpP，能有效地殺滅革蘭陰性菌[46]。

除ADEP外，以ClpP為靶點的藥物還有β-內(nèi)酯(β-lactones)類小分子化合物，該類化合物可降低金黃色葡萄球菌毒性，體外實驗結(jié)果顯示，β-內(nèi)酯還能在ClpP2絲氨酸活性位點處形成共價結(jié)合物致使Mtb的ClpP1P2肽酶復(fù)合物失活，從而影響Mtb毒力。在惡性瘧原蟲中，β-內(nèi)酯也顯示出了良好的ClpP抑制作用，實驗表明，β-內(nèi)酯處理顯著抑制了無性期寄生蟲的體外生長，經(jīng)β-內(nèi)酯處理的寄生蟲在裂殖體晚期表現(xiàn)出發(fā)育停滯現(xiàn)象[47]。盡管它在體外試驗中獲得了理想殺菌或寄生蟲效果，但是由于該類化合物的水溶解能力差，血漿穩(wěn)定性低，限制了它們的臨床應(yīng)用。此外，Hackl等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在ClpP蛋白酶抑制實驗中，苯基酯(phenyl esters)類化合物的效價大大超過了β-內(nèi)酯，并在金黃色葡萄球菌中顯示出獨特的靶向選擇性；然而，β-內(nèi)酯仍然是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的ClpP特異性抑制劑。

Griffith等[49]采用靶向合成手段獲得了一類新型ClpP激活劑脲縮酚肽(ureadepsipeptides)，該類化合物用苯基脲(phenyl urea)取代了縮酚肽(depsipeptide)，具有較高的代謝穩(wěn)定性。該研究證明脲縮酚肽是金黃色葡萄球菌ClpP的有效激活劑，對化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌甚至金黃色葡萄球菌生物膜等都具有良好的殺菌活性。

此外，硼替佐米作為一種已知的26S蛋白酶體抑制劑，也可抑制ClpP1P2蛋白酶復(fù)合物的活性[50]，但由于其成本高，藥代動力學(xué)差，半衰期短等，限制了該藥物在臨床中的應(yīng)用。值得一提的是，人類線粒體ClpP在人類非傳染性疾病中發(fā)揮了重要作用[51-52]，因其氨基酸序列與細(xì)菌、寄生蟲等的ClpP具有一定同源性，其結(jié)構(gòu)也十分相似[53]，這也限制了基于病原微生物ClpP的藥物的臨床應(yīng)用。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，ClpP與病原體胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解和細(xì)菌毒力密切相關(guān)。目前，與革蘭陽性菌相比，ClpP在革蘭陰性菌中的研究相對較少，對人類ClpP的生理功能和作用機(jī)制的研究還處于早期階段。本文對幾種調(diào)節(jié)細(xì)菌ClpP活性的小分子化合物進(jìn)行了綜述，然而這些化合物還未在人類線粒體ClpP中進(jìn)行詳細(xì)的研究，考慮到ClpP蛋白酶的序列保守性，目前仍不能排除針對細(xì)菌ClpP的化合物也對人ClpP活性產(chǎn)生影響。因此，在研究細(xì)菌ClpP相關(guān)靶點藥物時，必須考慮這些化合物會不會對人體產(chǎn)生影響。目前，雖然國內(nèi)外有多個針對ClpP的藥物開發(fā)計劃，但還沒有藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。Clp ATPase-ClpP蛋白酶復(fù)合物中復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，構(gòu)成了一個特別適合藥物開發(fā)的系統(tǒng)。ADEP和ACP類化合物通過阻止Clp ATP酶與ClpP蛋白酶之間的結(jié)合發(fā)揮抗菌作用，但同時也導(dǎo)致了ClpP蛋白酶激活而致使細(xì)胞死亡，在基于ClpP蛋白酶的藥理研究上，依然任重而道遠(yuǎn)。