韋喜梅 徐 勒 劉杰標(biāo)

廣西河池市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西河池 547000

小反芻獸疫又叫小反芻獸瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的高度接觸性動物傳染病，發(fā)病率和病死率可高達(dá)100%。該病的臨診表現(xiàn)與牛瘟相似，故也被稱為偽牛瘟，其特征是發(fā)病急劇、高熱稽留、眼鼻分泌物增加、口腔糜爛、腹瀉和肺炎，主要感染綿羊和山羊，危害相當(dāng)嚴(yán)重。本病被OIE 列入A 類動物疫病，該病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）必須通報的動物疫病，也是全球計劃根除的動物疫病，在我國被列為一類動物疫病[1]。2007年，小反芻獸疫首次傳入我國西藏阿里地區(qū)，但被迅速控制，未發(fā)生擴散[2]；2013年11月底，小反芻獸疫再次傳入我國并波及多個省份。近幾年來，河池市11個縣（區(qū)）從全國各地引進(jìn)各種品種的羊以及羊的飼養(yǎng)量的增加，使發(fā)生小反芻獸疫風(fēng)險升高，從2015年起河池市對羊群開始進(jìn)行小反芻獸疫強制免疫。為掌握全市小反芻獸疫免疫抗體和感染情況，科學(xué)評估免疫效果，評估小反芻獸疫發(fā)生的風(fēng)險，為指導(dǎo)河池市小反芻獸疫防控提供科學(xué)依據(jù)，從2015年開始進(jìn)行小反芻獸疫免疫效果和病原監(jiān)測，現(xiàn)把河池市近4年小反芻獸疫血清學(xué)和病原學(xué)監(jiān)測情況報告如下。

1 樣品與檢測方法

1.1 樣品采集

樣品主要來自全市11 個縣（區(qū)）定點監(jiān)測與日常監(jiān)測，每年春秋兩防檢查采集，采樣時詳細(xì)填寫采樣單，標(biāo)明采樣地點、采樣時間、免疫時間、疫苗生產(chǎn)企業(yè)等信息。

1.2 檢測方法

1）血清學(xué)檢測。采用阻斷ELISA 方法檢測免疫抗體水平，采用試劑盒廠家是青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，操作方法如下：①在包被板上設(shè)2 個陰性孔加入50 μL 陰性血清，2 個陽性孔加入50 μL 陽性血清，2 個空白對照孔，加入50 μL 稀釋液，剩余孔加入25 μL 樣品稀釋液，然后加入25 μL 樣品用于檢測；②輕輕搖勻孔中樣品，在37 ℃恒溫箱孵育60 min；③甩干包被板孔中的液體，每孔加入300 μL 洗滌液，洗滌4 次，拍干；④每孔加入50 μL酶標(biāo)抗體，在37 ℃恒溫箱30 min；⑤甩干包被板孔中的液體，每孔加入300 μL 工作濃度的洗滌液，洗滌4 次，拍干；⑥每孔加入50 μL 底物溶液，室溫下避光孵育15 min；⑦使用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的OD 值。

結(jié)果判定：陽性血清阻斷率=100-陽性O(shè)D 平均值/空白OD 平均值×100；陰性血清阻斷率=100-陰性O(shè)D 平均值/空白OD 平均值×100；樣品阻斷率=100-樣品OD 值/空白OD 平均值×100。

試驗成立條件：根據(jù)阻斷率判定檢驗結(jié)果：陽性阻斷率＞60，陰性阻斷率＜40，試驗結(jié)果有效，否則重新進(jìn)行試驗。判定：樣品阻斷率＞50，結(jié)果為陽性；樣品阻斷率＜50，結(jié)果為陰性。

2）病原學(xué)檢測。采用RT-PCR 方法檢測病毒核酸，選用的試劑盒為北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司小反芻獸疫RT-PCR 檢測試劑盒，操作步驟如下：

①病毒RNA 的提?。喝∫烟幚淼臉悠?、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液600 μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5 min；將液體吸入吸附柱中，13 000 r/min 離心30 s；棄去收集管中液體，加入600 μL 洗液，13 000 r/min 離心30 s，再重復(fù)1 次；棄去收集管中液體，13 000 r/min 空柱離心2 min，以除去殘留的洗滌液；將吸附柱移入新的1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min，13 000 r/min 離心30 s，離心管中液體即為模板RNA。

②RT-PCR 擴增。每份總體積20 μL，含16.8 μL RT-PCR 反應(yīng)液（用前混勻），1.2 μL 酶混合液，2 μL 模板RNA。在PCR 擴增儀上進(jìn)行以下程序：42 ℃45 min，94 ℃3 min；循環(huán)94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 次，再72 ℃延伸7 min。

③電泳。稱瓊脂糖1.5 g 置于500 mL 錐形瓶中，加入200 mL 50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液，放在微波爐中溶解，再加入10 μL 染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR 擴增產(chǎn)物10 μL 和上樣緩沖液2 μL 混合，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120 V 電壓與50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳，在成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

④結(jié)果判定。陽性對照出現(xiàn)350 bp 擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，試驗結(jié)果成立。檢測樣品出現(xiàn)350 bp 擴增帶判斷為小反芻獸疫病毒陽性，否則判為陰性。

2 結(jié) 果

2.1 總體情況

2017-2020年共檢測12 094 份血清，其中抗體合格樣品11 013 份，合格率為91.1%，已達(dá)到國家要求的70%以上的標(biāo)準(zhǔn)。病原學(xué)檢測樣品為3 770份，結(jié)果均為陰性（表1）。

表1 2017-2020年小反芻獸疫免疫抗體和病原檢測情況

2.2 不同年份的總體情況

2017-2020年抗體檢測數(shù)分別為2 804、3 195、3 084、2 681 份，抗體合格數(shù)分別為2 359、2 889、3 084、2 681 份，合格率分別為84.1%、90.4%、93.8%、95.5%。4年均達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的70%以上的要求；病原學(xué)檢測數(shù)分別為1 095、1 139、886、650 份，結(jié)果均為陰性。

2.3 規(guī)模場與散養(yǎng)戶的總體情況

規(guī)模場檢測的樣品總數(shù)為8 537 份，合格數(shù)為7 959 份，合格率為93.2%；散養(yǎng)戶檢測樣品總數(shù)為3 557 份，合格數(shù)為3 054 份，合格率為85.9%。

2.4 不同縣區(qū)的情況

2017-2020年在全市的11 個縣區(qū)小反芻獸疫免疫抗體合格率，除2017年有一個縣合格率為68%，低于國家標(biāo)準(zhǔn)外，其余地區(qū)均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（在70%以上）。不同縣區(qū)合格率會有所區(qū)別，但區(qū)別不大，都是逐年呈遞增；病原學(xué)檢測中無陽性（表2）。

表2 2017-2020年不同縣區(qū)血清學(xué)和病原學(xué)檢測情況

3 結(jié) 論

1）從監(jiān)測結(jié)果看，河池市小反芻獸疫免疫抗體合格率連續(xù)4年均達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的70%以上的要求，小反芻獸疫病原連續(xù)4年監(jiān)測結(jié)果均為陰性，表明河池市發(fā)生小反芻獸疫風(fēng)險低。

2）河池市小反芻疫免疫抗體的合格率連續(xù)4年均達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的70%以上的要求，由此可見養(yǎng)殖戶對于小反芻獸疫免疫越來越重視，認(rèn)識到防疫措施的重要性，以防為主，以治為輔。

3）從規(guī)模場和散養(yǎng)戶免疫抗體監(jiān)測結(jié)果看，規(guī)模場和散養(yǎng)戶免疫抗體的合格率都比較高，說明規(guī)模養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶對于防疫都比較重視，認(rèn)識到要防止小反芻疫的發(fā)生，防疫措施必須做得到位，以減少疫病的發(fā)生，減少成本，增加經(jīng)濟效益。

4）雖然河池市2017-2020年小反芻獸疫免疫抗體合格率都達(dá)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的70%以上的要求，病原監(jiān)測結(jié)果均為陰性，但是隨著河池市大量發(fā)展牛羊的產(chǎn)業(yè)，從外地引進(jìn)的羊只也會大量的增長，仍有感染小反芻獸疫的風(fēng)險，應(yīng)加強調(diào)運監(jiān)管、落實強制免疫、監(jiān)測與流行病調(diào)查等防控措施，強化養(yǎng)殖、交易、屠宰等責(zé)任，提高河池市整體防控的能力，開展培訓(xùn)班讓養(yǎng)殖戶了解其中的危害，加強防控意識，特別是散養(yǎng)戶，本身的意識薄弱，因此要提高他們的防控意識，從而提高養(yǎng)殖技術(shù)，降低成本，提高收入，為鄉(xiāng)村振興助力。