陳佳靈，黃穎而，鄧 昊，吳鴻峰，張 婧，趙奕君，羅佳豪，郝文波

（南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術(shù)學院抗體工程研究所，廣東 廣州 510515）

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）是細菌DNA中普遍存在的一段重復序列，參與細菌的免疫調(diào)節(jié)。當病毒等外源性DNA入侵細菌時，CRISPR相關(guān)蛋白，即Cas可獲取入侵病毒特定DNA序列并將其整合至CRISPR結(jié)構(gòu)的間隔序列中，從而對該外來序列產(chǎn)生永久性“記憶”，并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶作用，當再次感染時，能快速識別并摧毀病毒[1]。CRISPR與Cas簡稱為CRISPR-Cas系統(tǒng)，由其改造而成的CRISPR-Cas技術(shù)是目前主要的基因編輯工具，已被廣泛應用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域[2]。

Cas分為兩大類6個亞類，其中CRISPR大類中包括Ⅱ（Cas9）[3]、Ⅴ（Cas12）[4]和Ⅵ（Cas13）[5]亞類。有著“基因魔剪”之稱的Cas9被研究者廣泛運用于各項生物醫(yī)學領(lǐng)域，成為基因篩選、靶向編輯、功能基因組學分析等的有力工具。但Cas9僅能實現(xiàn)在DNA水平的編輯和靶向清除，存在脫靶效應，不能應用于各種靶標序列檢測和靶向清除RNA。為了解決Cas9在基因編輯中脫靶效應和靶向DNA的局限性，學者們致力于尋找一個能靶向RNA的基因編輯工具。

2015年，ABUDAYYEH等[6]用Cas1作為“誘餌”來鑒定細菌基因組中與CRISPR相關(guān)聯(lián)的蛋白，發(fā)現(xiàn)了一種新型核酸酶——Cas13a，又稱C2c2，并對其進行相關(guān)表征分析，發(fā)現(xiàn)Cas13a具有特異性識別并切割RNA和敲除細菌中特定mRNA，降低基因表達量的特點。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)發(fā)展成為一種快速的體外核酸診斷技術(shù)和高效、精準的基因編輯工具。

1 Cas13a切割RNA的分子機制

要研究Cas13a如何切割RNA的分子機制，首先應了解該蛋白的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。2017年，LIU等[7]利用高分辨電鏡衍射數(shù)據(jù)解析了Cas13a與向?qū)NA（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-derived RNA，crRNA）的二元復合物及Cas13a的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cas13a是“雙葉”的球狀蛋白質(zhì)，由crRNA “識別”葉和“核酸酶”葉構(gòu)成?！白R別”葉包含N端域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結(jié)構(gòu)域，“核酸酶”葉由Helical-2、Helical-3、具有RNA酶活性的高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合域（higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN）1和HEPN2結(jié)構(gòu)域組成。發(fā)揮核酸酶切割活性的位點在Helical-1和HEPN結(jié)構(gòu)域上。當crRNA-靶標RNA形成的二元復合物結(jié)合在Cas13a中的核酸酶帶正電荷的中心通道時，會觸發(fā)Cas13a中的HEPN1結(jié)構(gòu)域向HEPN2結(jié)構(gòu)域移動，從而發(fā)生構(gòu)象變化。蛋白質(zhì)外表面的 Cas13a HEPN催化位點活化，發(fā)揮雙重核酸酶活性，一種用于切割其RNA靶標，另一種用于加工crRNA。LIU等[7]的研究從結(jié)構(gòu)上揭示了Cas13a切割靶標 RNA的分子機制，也為未來Cas13a在基因編輯和分子診斷領(lǐng)域的應用奠定了基礎(chǔ)。

2 CPISPR-Cas13a系統(tǒng)在基因組編輯中的應用

2.1 用于抗病毒治療

在植物抗病毒作用方面，BHUSHAN[8]發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas13a系統(tǒng)能夠使單、雙子葉植物有效地抵抗RNA病毒的入侵，長期穩(wěn)定地保持植物對抗病毒的能力。在人類抗病毒作用方面，使用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)編輯登革熱病毒的NS3基因核苷酸序列第46574685位靶點后可使登革熱病毒失去復制能力[9]。利用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)靶向人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的tat、rev、gag等基因編碼區(qū)[10]，抑制HIV-1復制。CRISPR-Cas13a系統(tǒng)通過靶向RNA的核酸酶切活性破壞病毒基因組的方式，不易導致病毒產(chǎn)生對抗病毒藥物的耐藥性，具有效率高、特異性強、可編程的特點。

2.2 用于腫瘤靶向治療

CRISPR-Cas13a系統(tǒng)在真核細胞，特別是腫瘤中的研究尚在起步階段。WANG等[11]等的研究結(jié)果顯示，Cas13a可在過表達膠質(zhì)瘤表皮生長因子受體Ⅲ型突變的U87細胞中發(fā)揮核酸酶活性，抑制和殺傷膠質(zhì)瘤細胞。CHEN等[12]利用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)使人乳頭瘤病毒16型和18型的E6基因失活，從而降低了宮頸癌患者的病死率。ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)，Cas13a能特異性地區(qū)分KARS mRNA突變型和野生型，并能有效沉默突變的KRAS基因表達，實現(xiàn)對胰腺癌突變基因精確的定點靶向治療。由此可見，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)在殺傷腫瘤細胞和腫瘤治療中具有巨大的應用前景。

2.3 潛在應用

CRISPR-Cas13a系統(tǒng)發(fā)揮抗病毒和腫瘤殺傷作用都是建立在Cas13a發(fā)揮核酸酶作用的基礎(chǔ)上。而核酸酶活性缺失的Cas13a因喪失了RNA切割活性，只能結(jié)合RNA，因此可將其與熒光探針結(jié)合，標記活細胞，分析活細胞內(nèi)基因表達的蛋白分布及亞細胞定位；或與人源的RNA腺嘌呤脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域融合，引入到裂殖酵母中，實現(xiàn)對內(nèi)源RNA的精確定點編輯[14]。

3 基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的核酸體外診斷技術(shù)

除了作為基因編輯工具外，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)本身還具有“附屬切割”特性，因此在分子診斷領(lǐng)域更具應用潛力。

3.1 特異性高靈敏度酶報告系統(tǒng)（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）

2016年，EAST-SELETSKY等[15]首次將CRISPR-Cas13a系統(tǒng)應用于對靶標RNA的檢測，發(fā)現(xiàn)其靈敏度太低，缺乏實際應用價值。2017年，張鋒團隊首次將Cas13a與重組聚合酶等溫擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）結(jié)合，并將其改造成一種有實際應用價值的診斷工具——SHERLOCK[16]。SHERLOCK技術(shù)的基本原理為：樣本中的特異性核酸序列先經(jīng)RPA（檢測DNA靶標）或逆轉(zhuǎn)錄酶-重組酶聚合酶恒溫擴增技術(shù)（reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification，RT-RPA）（檢測RNA靶標）進行擴增，然后進行T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄，合成大量的RNA產(chǎn)物；當Cas13a和crRNA結(jié)合，并識別靶標RNA序列之后，激活Cas13a核酸酶活性，切割靶標的RNA序列與“附帶切割”反應體系中的熒光RNA探針（正常情況下不發(fā)光，一旦被RNA酶剪斷，就會發(fā)光）；最后，通過熒光檢測報告分析系統(tǒng)檢測對應的熒光信號。目前，SHERLOCK技術(shù)已被成功用于寨卡病毒[17]、埃博拉病毒[18]、登革熱病毒[9]、甲型流感病毒[19]等病原體及其耐藥基因、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等多種靶標檢測。SHERLOCK技術(shù)的基本原理見圖1。

圖1 SHERLOCK技術(shù)原理圖[16]

3.2 SHERLOCK V2

第1代SHERLOCK技術(shù)存在一定的局限性，無法達到便攜、多重檢測和高靈敏度的性能要求。為了解決這些問題，張鋒團隊又開發(fā)出SHERLOCK version 2系統(tǒng)（SHERLOCK V2）[20]，利用不同的 Cas酶表現(xiàn)出不同程度的“偏愛”切割特性，同時將多種不同特異性熒光探針引入檢測系統(tǒng)，進行多種核酸檢測，可在1份樣本中同時檢測多種病毒。SHERLOCK V2還利用側(cè)流層析方法實現(xiàn)了快速檢測。當Cas13a切割RNA熒光探針時，探針兩端連接的6-羧基熒光素（6-carboxy fluorescein，F(xiàn)AM）與生物素分別結(jié)合到試紙條的不同區(qū)域，在2 h內(nèi)即可將結(jié)果直觀地展現(xiàn)在試紙條上，擺脫了檢測體系對熒光讀數(shù)儀器的依賴，可以凍干試劑并在室溫保存，可在實驗室和篩查現(xiàn)場進行快速、準確的檢測。有研究結(jié)果顯示，采用基于SHERLOCK V2的試紙條可在1 h內(nèi)判斷樣本內(nèi)是否含有嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2），最低檢測限為10～100拷貝/μL[21]。相對于SHERLOCK，改良后的SHERLOCK V2沒有了定性的限制，檢測性能有了較大的提升。SHERLOCK V2系統(tǒng)示意圖見圖2。

圖2 SHERLOCK V2系統(tǒng)示意圖[20]

3.3 結(jié)合其他方法學的檢測技術(shù)

WANG等[22]建立了基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的核酸檢測方法，采用PCR-CRISPR技術(shù)檢測乙型肝炎病毒DNA，實現(xiàn)了乙型肝炎病毒低載量樣本中病毒核酸和耐藥基因單堿基突變的檢測，相對于檢測成本高、穩(wěn)定性差的RPA，更具臨床實用性。此外，在腫瘤的早期診斷上，微小RNA（microRNA，miRNA）的異常表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在著直接或間接的關(guān)系。BRUCH等[23]構(gòu)建了基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的便攜式雙電極電化學發(fā)光生物傳感平臺，無需信號放大，可在30 min內(nèi)準確定量檢測樣本中的miRNA，為腫瘤的早期診斷提供了新的檢測技術(shù)和思路。

4 小結(jié)與展望

CRISPR-Cas13a系統(tǒng)是強大的基因編輯及分子診斷工具，通過在mRNA水平的編輯，不涉及編碼基因DNA的改變，避免了安全和倫理問題。不僅彌補了現(xiàn)有基因編輯工具脫靶效應的缺陷，還為目前難以或無法治愈的疾病治療拓寬了思路。在人類感染和臨床基因疾病快速診斷、治療（基因編輯）等方面具有廣闊的應用前景。