沈素雅，黃建釗，李小懷

（1.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是指因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤脫落進(jìn)入血流，在循環(huán)系統(tǒng)中存活，從而轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，可在血液中被檢測(cè)到[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，腫瘤患者的死亡90%是腫瘤轉(zhuǎn)移所致，早期診斷和治療可以提高腫瘤的治療效果[2]。因此，開(kāi)展CTC的系統(tǒng)研究，對(duì)于腫瘤的診斷、個(gè)體化治療、藥物開(kāi)發(fā)、預(yù)后評(píng)估等具有重要的意義。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，CTC作為腫瘤生物標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)后評(píng)估的研究逐漸成為熱點(diǎn)。由于CTC在血液中含量極少，富集和檢測(cè)技術(shù)成為制約其臨床應(yīng)用的瓶頸。本文對(duì)CTC富集分離技術(shù)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為日后其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考。

1 CTC的研究?jī)r(jià)值及分離技術(shù)難點(diǎn)

CTC在腫瘤診斷和預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值已被證實(shí)[3]，如可以確定疾病的階段、監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)。相對(duì)于傳統(tǒng)影像學(xué)檢測(cè)和穿刺活檢等方法，以血液檢測(cè)形式進(jìn)行的CTC檢測(cè)，更加安全。通過(guò)檢測(cè)有無(wú)CTC，可輔助判斷腫瘤發(fā)生與否。另外，CTC含量可隨病情和治療狀況的變化而變化，因此還可以用于腫瘤預(yù)后的評(píng)估。此外，將富集的CTC進(jìn)行離體培養(yǎng)[4]，可能有助于動(dòng)物模型中腫瘤轉(zhuǎn)移的功能研究，分析腫瘤對(duì)各種治療反應(yīng)的藥理學(xué)作用，開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的干預(yù)治療藥物。

目前，從患者樣本中富集CTC仍是一項(xiàng)技術(shù)難題，因?yàn)镃TC檢測(cè)技術(shù)需要將腫瘤細(xì)胞從全血中分離出來(lái)，但用于識(shí)別CTC的生物標(biāo)志物并不具有足夠的特異性，即使是在同一患者體內(nèi)，也沒(méi)有單一的生物標(biāo)志物可以識(shí)別所有的CTC。由于每毫升血液中大約只有數(shù)個(gè)CTC，而正常的血細(xì)胞有數(shù)十億個(gè)[5]，另外還存在各種蛋白質(zhì)、核酸、糖類等物質(zhì)，使富集效果的靈敏度受到較大影響。此外，血液樣本的處理包括對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行預(yù)標(biāo)記、固定細(xì)胞、裂解紅細(xì)胞、預(yù)過(guò)濾和樣本稀釋等過(guò)程。雖然這些處理的目的通常是通過(guò)放大靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞之間的對(duì)比來(lái)輔助富集過(guò)程，但可能會(huì)干擾下游基因的檢測(cè)、發(fā)生細(xì)胞損失，從而影響該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的實(shí)際效能。

2 CTC的主要富集方法

2.1 基于生物物理學(xué)特性的富集方法

細(xì)胞的生物物理特性取決于細(xì)胞內(nèi)在特征（大小、密度、變形性和電學(xué)性質(zhì)等）的差異，該特性是區(qū)分CTC與血液其他成分的標(biāo)記，可用來(lái)實(shí)現(xiàn)CTC的分離和富集，主要包括以下幾類方法。

2.1.1 基于微流控的富集法 微流控技術(shù)主要利用CTC和背景細(xì)胞之間的物理或生物差異來(lái)實(shí)現(xiàn)CTC的富集，由于其具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、處理能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在CTC的富集中被廣泛應(yīng)用。膜濾過(guò)富集法通過(guò)濾膜過(guò)濾分離出CTC，較少受CTC表型改變的影響，如市售的ISET（法國(guó)Rarecell公司）[6]和ScreenCell（法國(guó)ScreenCell公司）[7]設(shè)備能夠較好地保持細(xì)胞原有形態(tài)，但易混雜其他血細(xì)胞，導(dǎo)致富集純度偏低，更適用于CTC富集的預(yù)處理。密度梯度離心法利用分離介質(zhì)及高速離心使存在密度差異的細(xì)胞群落分層，也屬于“無(wú)標(biāo)記”法。如OncoQuick法（德國(guó)Greiner Bio-one公司）通過(guò)內(nèi)置多孔屏障，防止分離后的CTC被全血細(xì)胞污染，提高了富集效率，但成本高，用血量大，且易受離心時(shí)間、環(huán)境因素的影響[8]。近期國(guó)外有研究者開(kāi)發(fā)出一種新型微濾裝置，可實(shí)現(xiàn)樣本處理、免疫染色、熒光分析等步驟的自動(dòng)化，捕獲率為93%，且分離出的細(xì)胞能繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)分析，有望成為臨床實(shí)踐中有廣闊應(yīng)用前景的方法[9]，但尚需大規(guī)模臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1.2 基于流體力學(xué)的富集技術(shù) 流體力學(xué)方法主要基于不同細(xì)胞所受液體動(dòng)力的影響不同進(jìn)行富集。（1）確定性側(cè)向位移（deterministic lateral displacement，DLD）技術(shù)。利用微流控通道的層流特性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行尺寸識(shí)別，細(xì)胞撞擊在周期性移動(dòng)的微米柱上后，會(huì)沿不同方向游動(dòng)[10]，且不易發(fā)生堵塞[圖1（a）]。已有研究使用微流控芯片證明了DLD技術(shù)可在多種條件下有效分離微粒，且對(duì)細(xì)胞的存活率影響較小[11-12]。（2）慣性聚焦技術(shù)。利用慣性升力和Dean渦流原理將CTC與血細(xì)胞分離。LEE等[13]設(shè)計(jì)的縮-擴(kuò)微流控通道（contraction-expansion array，CEA）能夠直接從全血中分離出回收率達(dá)99.1%的CTC（純度為88.8%），但其準(zhǔn)確率會(huì)受流速的影響[圖1（b）]。WARKIANI等[14]根據(jù)此原理設(shè)計(jì)了一種螺旋微流控裝置，對(duì)癌細(xì)胞的捕獲率≥85%，對(duì)白細(xì)胞的去除率達(dá)99.99%。（3）渦流捕獲技術(shù)。利用細(xì)胞在微通道中受到的渦流力來(lái)捕獲CTC。RENIER等[15]利用Vortex芯片從晚期前列腺癌患者血液中分離CTC。Vortex芯片操作時(shí)間短、通量高、純度高，且無(wú)需標(biāo)記，適用于臨床各類樣本和腫瘤類型，但需精確控制樣本流量和裝置的幾何形狀。

2.1.3 基于超聲波的富集技術(shù) 依靠超聲波對(duì)微流體產(chǎn)生的震蕩壓力分離CTC，可保持細(xì)胞的完整性和存活率。細(xì)胞所受到的力與其大小、密度、可壓縮性成正比，可使其以不同的速度和方向流向相應(yīng)的通道。ANTFOLK等[16]設(shè)計(jì)的微流控芯片使CTC在較高頻的聲波作用下被選擇性地移向壓力通道的中心，而較小的白細(xì)胞則向壁側(cè)運(yùn)動(dòng)[圖1（c）]，對(duì)前列腺癌細(xì)胞系DU145的回收率為（94.8±2.8）%，污染率為（2.2±0.6）%。LI等[17]利用超聲波操縱微粒，在細(xì)胞和生物體研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一個(gè)與微流控通道具有一定角度的附加表面聲波裝置，通過(guò)優(yōu)化裝置參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了乳腺癌患者CTC的高效富集[圖1（d）]?；诼暡ǖ母患夹g(shù)較溫和，且具有生物兼容的特性，但其通量有待提高，迫切需要開(kāi)發(fā)高性價(jià)比的富集技術(shù)。

圖1 不同CTC富集技術(shù)示意圖

2.1.4 基于電泳的富集技術(shù) 在基于雙向電泳（dimensional electrophoresis，DEP）的富集技術(shù)中，不同介電常數(shù)的細(xì)胞在電場(chǎng)中所受到的電場(chǎng)力的大小和方向會(huì)有所差異，通過(guò)設(shè)置電激頻率，可將細(xì)胞群朝相應(yīng)的方向驅(qū)動(dòng)。CHENG等[18]采用DEP富集裝置，使用3D的V形彎形通道，在電場(chǎng)力作用下對(duì)CTC進(jìn)行電泳分離，該裝置對(duì)肺癌細(xì)胞株AS2-GFP的回收率達(dá)到85%（純度為90%）。利用CTC固有的電學(xué)特性，“無(wú)標(biāo)記”且腫瘤細(xì)胞存活率高、分選純度高，使DEP富集技術(shù)較具吸引力，但僅憑微弱的電泳力很難快速感應(yīng)到CTC，若用于臨床應(yīng)用中，還需對(duì)其富集效率和純度進(jìn)一步完善。

2.2 基于生物化學(xué)特性的富集方法

CTC的生物化學(xué)特性主要體現(xiàn)在CTC的細(xì)胞膜上存在的配體與腫瘤特異性抗原之間的高度特異性作用。大多數(shù)富集方法是將親和配體（抗體或適配體）固載于微通道或磁珠上，通過(guò)增加細(xì)胞與配體的接觸，實(shí)現(xiàn)高效率、高純度的富集效果。

2.2.1 基于抗體的富集方法 以抗體為基礎(chǔ)的方法是利用CTC與血細(xì)胞之間特異性細(xì)胞膜抗原表達(dá)的差異分離CTC，主要有免疫磁珠和固載抗體微通道2種方法。免疫磁珠法的基本原理是帶有磁珠的抗體與CTC表面抗原結(jié)合，在磁場(chǎng)的作用下使CTC與血細(xì)胞分離。SALIBA等[19]開(kāi)發(fā)了一種具有抗體功能和超順磁珠的微流控設(shè)備，捕獲效率超過(guò)94%，但由于易受流體動(dòng)力阻力的影響，其通量較低。張磊等[20]利用免疫磁珠法和免疫熒光技術(shù)建立了一種高效的CTC陰性富集方法和免疫熒光鑒定方法，CTC回收率為62.5%～95.0%，但仍需進(jìn)行大量的臨床樣本研究加以驗(yàn)證。目前，上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是最常用的生物標(biāo)志物，采用EpCAM結(jié)合免疫磁珠可捕獲肺癌[21]、結(jié)直腸癌[22]、乳腺癌[23]等腫瘤患者的CTC。但由于CTC存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，可能會(huì)造成假陰性結(jié)果，且細(xì)胞在磁場(chǎng)中極易發(fā)生聚集，分離與磁珠結(jié)合的細(xì)胞可能會(huì)影響后續(xù)檢測(cè)。因此，尋找腫瘤細(xì)胞的特異性靶標(biāo)，并使用多種生物標(biāo)志物進(jìn)行CTC分離和計(jì)數(shù)是未來(lái)富集技術(shù)的重要研究方向。除免疫磁珠外，還可將抗體固載于微流控芯片中捕獲CTC，其優(yōu)點(diǎn)在于富集流程高度自動(dòng)化，且能使富集的CTC保持較高的活性。微通道雖可增加細(xì)胞與配體的接觸，但易阻塞，不利于高通量檢測(cè)。STOTT等[24]在微通道混合的研究基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了HB-Chip，通過(guò)產(chǎn)生微渦流使CTC與抗體接觸增加，對(duì)前列腺癌細(xì)胞的捕獲效率為普通芯片的2.7倍，且比CTC-Chip的捕獲率高26.3%。CHENG等[25]開(kāi)發(fā)了一種3D支架芯片，進(jìn)一步提高了全血CTC的捕獲率。基于抗體的富集方法在識(shí)別靶細(xì)胞方面具有較高的特異性，被廣泛用于CTC富集技術(shù)中，但其重復(fù)性差、保存期短、成本高、釋放過(guò)程復(fù)雜等，未來(lái)需要克服這些技術(shù)難題。

2.2.2 基于適配體的富集方法 適配體可以識(shí)別并特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合，具有親和力高、可重復(fù)、保質(zhì)期長(zhǎng)、成本低、易與多種功能基團(tuán)結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)。ZHAO等[26]在微流控通道的硅納米線基底表面固定多種適配體，發(fā)現(xiàn)不同適配體間的協(xié)同作用增強(qiáng)了捕獲的親和力，提高了CTC用于腫瘤臨床監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。LABIB等[27]開(kāi)發(fā)了一種新型2D微流控技術(shù)，CTC先被適配體偶聯(lián)的磁性納米顆粒標(biāo)記，再根據(jù)各表面標(biāo)志物的表達(dá)水平不同對(duì)CTC進(jìn)行分類，提高了CTC富集的敏感性。

2.3 多種方法相結(jié)合的CTC富集方法

CTC分離富集策略多樣，但各有優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。因此，通過(guò)優(yōu)化裝置將多種方法組合在同一設(shè)備中，或能避開(kāi)各自的不足，并為CTC富集提供更高的靈敏度和特異性。KARABACAK等[28]開(kāi)發(fā)的CTC-iChip將DLD技術(shù)、慣性聚焦技術(shù)和基于親和力的負(fù)性篩選方法通過(guò)磁泳技術(shù)結(jié)合在同一臺(tái)設(shè)備中，實(shí)現(xiàn)了更高的回收率，純度也大大提高。WANG等[29]將DLD技術(shù)與磁激活細(xì)胞分選技術(shù)集成在一起，建立了不依賴腫瘤抗原的高效分離方法。PARK等[30]采用免疫親和、密度梯度離心和微流控芯片聯(lián)合來(lái)富集全血中的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌細(xì)胞株DMS-79，提高了CTC富集的回收率，降低了白細(xì)胞污染，且DMS-79細(xì)胞（89%）和MCF-7細(xì)胞（99%）的回收率都很高。JACK等[31]開(kāi)發(fā)了一種超特異性微流控技術(shù)，通過(guò)慣性力對(duì)血液樣本進(jìn)行預(yù)處理，然后用EpCAM功能化磁珠標(biāo)記CTC，再用磁泳法分離CTC。雖然多種技術(shù)的結(jié)合可以極大地增強(qiáng)CTC檢測(cè)的敏感性和特異性，提高富集效率，但需要對(duì)微流控設(shè)備進(jìn)行復(fù)雜的設(shè)計(jì)，不同方法之間的集成度較低，操作更復(fù)雜，制造成本更高，這些缺點(diǎn)限制了富集技術(shù)的商品化發(fā)展。因此，有必要開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、集成度高、性能好的微流控裝置，用于CTC的富集分離。CTC富集分離技術(shù)目前的應(yīng)用情況見(jiàn)表2。

表1 不同CTC富集技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

表2 CTC富集技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

3 總結(jié)與展望

CTC富集分離與檢測(cè)技術(shù)正逐漸被應(yīng)用于臨床，通過(guò)評(píng)估腫瘤異質(zhì)性、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC的變化，有助于早期診斷疾病，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。從腫瘤患者的血液樣本中直接富集CTC，可以提供一種替代創(chuàng)傷性手術(shù)活檢的方法，并通過(guò)系列的“液體”活檢，實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。但各項(xiàng)CTC富集分離技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)不一，將研究成果真正轉(zhuǎn)化并應(yīng)用于臨床，還需要對(duì)其進(jìn)行改良。將物理特性、化學(xué)特性與微流控技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)多種方法結(jié)合的分離和富集方法，是CTC捕獲的重要研究方向。這需要深入理解CTC的特性，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確捕獲，以開(kāi)發(fā)更加高效的富集檢測(cè)技術(shù)。隨著CTC富集檢測(cè)技術(shù)水平的提高，CTC結(jié)合影像學(xué)或病理學(xué)方法，可更加全面、精確地反映患者病情，進(jìn)而選擇適合的治療方式。

目前，從臨床樣本中有效富集CTC仍然是一個(gè)難題，為了更好地滿足臨床要求，以下幾個(gè)問(wèn)題值得注意：（1）CTC的富集方法很多，但富集數(shù)量仍十分有限，更高的富集效率可能需要新技術(shù)或多種技術(shù)相結(jié)合，需深入探索；（2）探究腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，尋找特異性CTC的靶標(biāo)，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的富集分離，是目前CTC檢測(cè)真正進(jìn)入臨床的主要瓶頸，尚需更多臨床研究結(jié)果驗(yàn)證靶標(biāo)的有效性；（3）由于CTC的播散規(guī)律尚不清楚，且腫瘤細(xì)胞常常隨機(jī)脫落入血，CTC的檢測(cè)時(shí)間尚需進(jìn)一步確認(rèn)；（4）外周血中CTC極少，CTC隨機(jī)脫落入血存在一定的數(shù)量波動(dòng)，易對(duì)病情判斷和預(yù)后評(píng)估造成誤差，需要進(jìn)行多中心、大樣本、長(zhǎng)周期的基礎(chǔ)研究，獲取CTC相關(guān)的生物學(xué)特征和信息；（5）不同的富集方法使用不同的富集設(shè)備和條件，其靈敏度和特異性均有差異，而這些差異可能會(huì)影響結(jié)果的可比性；（6）CTC對(duì)腫瘤的早期診斷和分期判斷具有重要意義，CTC計(jì)數(shù)和表型的轉(zhuǎn)變可在一定程度上指導(dǎo)臨床決策，但尚需開(kāi)展更多針對(duì)CTC表型與腫瘤發(fā)展和治療關(guān)系的研究。

綜上所述，CTC富集技術(shù)的敏感性、特異性、精確性和可重復(fù)性目前仍難以客觀判斷。盡管困難重重，但隨著該技術(shù)的飛速發(fā)展，CTC富集的便捷性和實(shí)效性將會(huì)進(jìn)一步提升，CTC富集技術(shù)必將擁有廣闊的應(yīng)用前景。