沈素雅，黃建釗，李小懷

（1.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550000）

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是指因自發(fā)或診療操作從實體腫瘤脫落進入血流，在循環(huán)系統(tǒng)中存活，從而轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，可在血液中被檢測到[1]。據(jù)統(tǒng)計，腫瘤患者的死亡90%是腫瘤轉(zhuǎn)移所致，早期診斷和治療可以提高腫瘤的治療效果[2]。因此，開展CTC的系統(tǒng)研究，對于腫瘤的診斷、個體化治療、藥物開發(fā)、預(yù)后評估等具有重要的意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，CTC作為腫瘤生物標(biāo)志物進行預(yù)后評估的研究逐漸成為熱點。由于CTC在血液中含量極少，富集和檢測技術(shù)成為制約其臨床應(yīng)用的瓶頸。本文對CTC富集分離技術(shù)的最新研究進展進行綜述，為日后其在臨床實踐中的應(yīng)用提供參考。

1 CTC的研究價值及分離技術(shù)難點

CTC在腫瘤診斷和預(yù)后中的應(yīng)用價值已被證實[3]，如可以確定疾病的階段、監(jiān)測患者對治療的反應(yīng)。相對于傳統(tǒng)影像學(xué)檢測和穿刺活檢等方法，以血液檢測形式進行的CTC檢測，更加安全。通過檢測有無CTC，可輔助判斷腫瘤發(fā)生與否。另外，CTC含量可隨病情和治療狀況的變化而變化，因此還可以用于腫瘤預(yù)后的評估。此外，將富集的CTC進行離體培養(yǎng)[4]，可能有助于動物模型中腫瘤轉(zhuǎn)移的功能研究，分析腫瘤對各種治療反應(yīng)的藥理學(xué)作用，開發(fā)針對腫瘤轉(zhuǎn)移的干預(yù)治療藥物。

目前，從患者樣本中富集CTC仍是一項技術(shù)難題，因為CTC檢測技術(shù)需要將腫瘤細胞從全血中分離出來，但用于識別CTC的生物標(biāo)志物并不具有足夠的特異性，即使是在同一患者體內(nèi)，也沒有單一的生物標(biāo)志物可以識別所有的CTC。由于每毫升血液中大約只有數(shù)個CTC，而正常的血細胞有數(shù)十億個[5]，另外還存在各種蛋白質(zhì)、核酸、糖類等物質(zhì)，使富集效果的靈敏度受到較大影響。此外，血液樣本的處理包括對靶細胞進行預(yù)標(biāo)記、固定細胞、裂解紅細胞、預(yù)過濾和樣本稀釋等過程。雖然這些處理的目的通常是通過放大靶細胞和非靶細胞之間的對比來輔助富集過程，但可能會干擾下游基因的檢測、發(fā)生細胞損失，從而影響該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的實際效能。

2 CTC的主要富集方法

2.1 基于生物物理學(xué)特性的富集方法

細胞的生物物理特性取決于細胞內(nèi)在特征（大小、密度、變形性和電學(xué)性質(zhì)等）的差異，該特性是區(qū)分CTC與血液其他成分的標(biāo)記，可用來實現(xiàn)CTC的分離和富集，主要包括以下幾類方法。

2.1.1 基于微流控的富集法 微流控技術(shù)主要利用CTC和背景細胞之間的物理或生物差異來實現(xiàn)CTC的富集，由于其具有設(shè)計簡單、操作簡便、處理能力強等優(yōu)點，在CTC的富集中被廣泛應(yīng)用。膜濾過富集法通過濾膜過濾分離出CTC，較少受CTC表型改變的影響，如市售的ISET（法國Rarecell公司）[6]和ScreenCell（法國ScreenCell公司）[7]設(shè)備能夠較好地保持細胞原有形態(tài)，但易混雜其他血細胞，導(dǎo)致富集純度偏低，更適用于CTC富集的預(yù)處理。密度梯度離心法利用分離介質(zhì)及高速離心使存在密度差異的細胞群落分層，也屬于“無標(biāo)記”法。如OncoQuick法（德國Greiner Bio-one公司）通過內(nèi)置多孔屏障，防止分離后的CTC被全血細胞污染，提高了富集效率，但成本高，用血量大，且易受離心時間、環(huán)境因素的影響[8]。近期國外有研究者開發(fā)出一種新型微濾裝置，可實現(xiàn)樣本處理、免疫染色、熒光分析等步驟的自動化，捕獲率為93%，且分離出的細胞能繼續(xù)進行分子生物學(xué)分析，有望成為臨床實踐中有廣闊應(yīng)用前景的方法[9]，但尚需大規(guī)模臨床研究進行驗證。

2.1.2 基于流體力學(xué)的富集技術(shù) 流體力學(xué)方法主要基于不同細胞所受液體動力的影響不同進行富集。（1）確定性側(cè)向位移（deterministic lateral displacement，DLD）技術(shù)。利用微流控通道的層流特性對細胞進行尺寸識別，細胞撞擊在周期性移動的微米柱上后，會沿不同方向游動[10]，且不易發(fā)生堵塞[圖1（a）]。已有研究使用微流控芯片證明了DLD技術(shù)可在多種條件下有效分離微粒，且對細胞的存活率影響較小[11-12]。（2）慣性聚焦技術(shù)。利用慣性升力和Dean渦流原理將CTC與血細胞分離。LEE等[13]設(shè)計的縮-擴微流控通道（contraction-expansion array，CEA）能夠直接從全血中分離出回收率達99.1%的CTC（純度為88.8%），但其準(zhǔn)確率會受流速的影響[圖1（b）]。WARKIANI等[14]根據(jù)此原理設(shè)計了一種螺旋微流控裝置，對癌細胞的捕獲率≥85%，對白細胞的去除率達99.99%。（3）渦流捕獲技術(shù)。利用細胞在微通道中受到的渦流力來捕獲CTC。RENIER等[15]利用Vortex芯片從晚期前列腺癌患者血液中分離CTC。Vortex芯片操作時間短、通量高、純度高，且無需標(biāo)記，適用于臨床各類樣本和腫瘤類型，但需精確控制樣本流量和裝置的幾何形狀。

2.1.3 基于超聲波的富集技術(shù) 依靠超聲波對微流體產(chǎn)生的震蕩壓力分離CTC，可保持細胞的完整性和存活率。細胞所受到的力與其大小、密度、可壓縮性成正比，可使其以不同的速度和方向流向相應(yīng)的通道。ANTFOLK等[16]設(shè)計的微流控芯片使CTC在較高頻的聲波作用下被選擇性地移向壓力通道的中心，而較小的白細胞則向壁側(cè)運動[圖1（c）]，對前列腺癌細胞系DU145的回收率為（94.8±2.8）%，污染率為（2.2±0.6）%。LI等[17]利用超聲波操縱微粒，在細胞和生物體研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計了一個與微流控通道具有一定角度的附加表面聲波裝置，通過優(yōu)化裝置參數(shù)，實現(xiàn)了乳腺癌患者CTC的高效富集[圖1（d）]?；诼暡ǖ母患夹g(shù)較溫和，且具有生物兼容的特性，但其通量有待提高，迫切需要開發(fā)高性價比的富集技術(shù)。

圖1 不同CTC富集技術(shù)示意圖

2.1.4 基于電泳的富集技術(shù) 在基于雙向電泳（dimensional electrophoresis，DEP）的富集技術(shù)中，不同介電常數(shù)的細胞在電場中所受到的電場力的大小和方向會有所差異，通過設(shè)置電激頻率，可將細胞群朝相應(yīng)的方向驅(qū)動。CHENG等[18]采用DEP富集裝置，使用3D的V形彎形通道，在電場力作用下對CTC進行電泳分離，該裝置對肺癌細胞株AS2-GFP的回收率達到85%（純度為90%）。利用CTC固有的電學(xué)特性，“無標(biāo)記”且腫瘤細胞存活率高、分選純度高，使DEP富集技術(shù)較具吸引力，但僅憑微弱的電泳力很難快速感應(yīng)到CTC，若用于臨床應(yīng)用中，還需對其富集效率和純度進一步完善。

2.2 基于生物化學(xué)特性的富集方法

CTC的生物化學(xué)特性主要體現(xiàn)在CTC的細胞膜上存在的配體與腫瘤特異性抗原之間的高度特異性作用。大多數(shù)富集方法是將親和配體（抗體或適配體）固載于微通道或磁珠上，通過增加細胞與配體的接觸，實現(xiàn)高效率、高純度的富集效果。

2.2.1 基于抗體的富集方法 以抗體為基礎(chǔ)的方法是利用CTC與血細胞之間特異性細胞膜抗原表達的差異分離CTC，主要有免疫磁珠和固載抗體微通道2種方法。免疫磁珠法的基本原理是帶有磁珠的抗體與CTC表面抗原結(jié)合，在磁場的作用下使CTC與血細胞分離。SALIBA等[19]開發(fā)了一種具有抗體功能和超順磁珠的微流控設(shè)備，捕獲效率超過94%，但由于易受流體動力阻力的影響，其通量較低。張磊等[20]利用免疫磁珠法和免疫熒光技術(shù)建立了一種高效的CTC陰性富集方法和免疫熒光鑒定方法，CTC回收率為62.5%～95.0%，但仍需進行大量的臨床樣本研究加以驗證。目前，上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是最常用的生物標(biāo)志物，采用EpCAM結(jié)合免疫磁珠可捕獲肺癌[21]、結(jié)直腸癌[22]、乳腺癌[23]等腫瘤患者的CTC。但由于CTC存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，可能會造成假陰性結(jié)果，且細胞在磁場中極易發(fā)生聚集，分離與磁珠結(jié)合的細胞可能會影響后續(xù)檢測。因此，尋找腫瘤細胞的特異性靶標(biāo)，并使用多種生物標(biāo)志物進行CTC分離和計數(shù)是未來富集技術(shù)的重要研究方向。除免疫磁珠外，還可將抗體固載于微流控芯片中捕獲CTC，其優(yōu)點在于富集流程高度自動化，且能使富集的CTC保持較高的活性。微通道雖可增加細胞與配體的接觸，但易阻塞，不利于高通量檢測。STOTT等[24]在微通道混合的研究基礎(chǔ)上開發(fā)了HB-Chip，通過產(chǎn)生微渦流使CTC與抗體接觸增加，對前列腺癌細胞的捕獲效率為普通芯片的2.7倍，且比CTC-Chip的捕獲率高26.3%。CHENG等[25]開發(fā)了一種3D支架芯片，進一步提高了全血CTC的捕獲率?；诳贵w的富集方法在識別靶細胞方面具有較高的特異性，被廣泛用于CTC富集技術(shù)中，但其重復(fù)性差、保存期短、成本高、釋放過程復(fù)雜等，未來需要克服這些技術(shù)難題。

2.2.2 基于適配體的富集方法 適配體可以識別并特異性地與靶細胞結(jié)合，具有親和力高、可重復(fù)、保質(zhì)期長、成本低、易與多種功能基團結(jié)合等優(yōu)點。ZHAO等[26]在微流控通道的硅納米線基底表面固定多種適配體，發(fā)現(xiàn)不同適配體間的協(xié)同作用增強了捕獲的親和力，提高了CTC用于腫瘤臨床監(jiān)測的準(zhǔn)確性。LABIB等[27]開發(fā)了一種新型2D微流控技術(shù)，CTC先被適配體偶聯(lián)的磁性納米顆粒標(biāo)記，再根據(jù)各表面標(biāo)志物的表達水平不同對CTC進行分類，提高了CTC富集的敏感性。

2.3 多種方法相結(jié)合的CTC富集方法

CTC分離富集策略多樣，但各有優(yōu)缺點，見表1。因此，通過優(yōu)化裝置將多種方法組合在同一設(shè)備中，或能避開各自的不足，并為CTC富集提供更高的靈敏度和特異性。KARABACAK等[28]開發(fā)的CTC-iChip將DLD技術(shù)、慣性聚焦技術(shù)和基于親和力的負性篩選方法通過磁泳技術(shù)結(jié)合在同一臺設(shè)備中，實現(xiàn)了更高的回收率，純度也大大提高。WANG等[29]將DLD技術(shù)與磁激活細胞分選技術(shù)集成在一起，建立了不依賴腫瘤抗原的高效分離方法。PARK等[30]采用免疫親和、密度梯度離心和微流控芯片聯(lián)合來富集全血中的乳腺癌細胞株MCF-7和肺癌細胞株DMS-79，提高了CTC富集的回收率，降低了白細胞污染，且DMS-79細胞（89%）和MCF-7細胞（99%）的回收率都很高。JACK等[31]開發(fā)了一種超特異性微流控技術(shù)，通過慣性力對血液樣本進行預(yù)處理，然后用EpCAM功能化磁珠標(biāo)記CTC，再用磁泳法分離CTC。雖然多種技術(shù)的結(jié)合可以極大地增強CTC檢測的敏感性和特異性，提高富集效率，但需要對微流控設(shè)備進行復(fù)雜的設(shè)計，不同方法之間的集成度較低，操作更復(fù)雜，制造成本更高，這些缺點限制了富集技術(shù)的商品化發(fā)展。因此，有必要開發(fā)操作簡單、集成度高、性能好的微流控裝置，用于CTC的富集分離。CTC富集分離技術(shù)目前的應(yīng)用情況見表2。

表1 不同CTC富集技術(shù)的優(yōu)缺點

表2 CTC富集技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

3 總結(jié)與展望

CTC富集分離與檢測技術(shù)正逐漸被應(yīng)用于臨床，通過評估腫瘤異質(zhì)性、動態(tài)監(jiān)測CTC的變化，有助于早期診斷疾病，實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。從腫瘤患者的血液樣本中直接富集CTC，可以提供一種替代創(chuàng)傷性手術(shù)活檢的方法，并通過系列的“液體”活檢，實現(xiàn)腫瘤的個體化治療。但各項CTC富集分離技術(shù)優(yōu)缺點不一，將研究成果真正轉(zhuǎn)化并應(yīng)用于臨床，還需要對其進行改良。將物理特性、化學(xué)特性與微流控技術(shù)結(jié)合，設(shè)計多種方法結(jié)合的分離和富集方法，是CTC捕獲的重要研究方向。這需要深入理解CTC的特性，對腫瘤細胞進行準(zhǔn)確捕獲，以開發(fā)更加高效的富集檢測技術(shù)。隨著CTC富集檢測技術(shù)水平的提高，CTC結(jié)合影像學(xué)或病理學(xué)方法，可更加全面、精確地反映患者病情，進而選擇適合的治療方式。

目前，從臨床樣本中有效富集CTC仍然是一個難題，為了更好地滿足臨床要求，以下幾個問題值得注意：（1）CTC的富集方法很多，但富集數(shù)量仍十分有限，更高的富集效率可能需要新技術(shù)或多種技術(shù)相結(jié)合，需深入探索；（2）探究腫瘤細胞生物學(xué)特性，尋找特異性CTC的靶標(biāo)，對腫瘤細胞進行準(zhǔn)確的富集分離，是目前CTC檢測真正進入臨床的主要瓶頸，尚需更多臨床研究結(jié)果驗證靶標(biāo)的有效性；（3）由于CTC的播散規(guī)律尚不清楚，且腫瘤細胞常常隨機脫落入血，CTC的檢測時間尚需進一步確認；（4）外周血中CTC極少，CTC隨機脫落入血存在一定的數(shù)量波動，易對病情判斷和預(yù)后評估造成誤差，需要進行多中心、大樣本、長周期的基礎(chǔ)研究，獲取CTC相關(guān)的生物學(xué)特征和信息；（5）不同的富集方法使用不同的富集設(shè)備和條件，其靈敏度和特異性均有差異，而這些差異可能會影響結(jié)果的可比性；（6）CTC對腫瘤的早期診斷和分期判斷具有重要意義，CTC計數(shù)和表型的轉(zhuǎn)變可在一定程度上指導(dǎo)臨床決策，但尚需開展更多針對CTC表型與腫瘤發(fā)展和治療關(guān)系的研究。

綜上所述，CTC富集技術(shù)的敏感性、特異性、精確性和可重復(fù)性目前仍難以客觀判斷。盡管困難重重，但隨著該技術(shù)的飛速發(fā)展，CTC富集的便捷性和實效性將會進一步提升，CTC富集技術(shù)必將擁有廣闊的應(yīng)用前景。