馬艷婷，蘇 曦，黃 斐，王夢嫻，沈敏娜，張春燕，王蓓麗，潘柏申，郭 瑋

（1.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；2.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361015）

由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染導(dǎo)致的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）會發(fā)展成肝衰竭、肝硬化及肝癌，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。用于治療CHB的藥物主要為核苷類似物（nucleotide analogue，NA）[2]。然而，NA并不能完全清除肝細胞內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），cccDNA持續(xù)存在是導(dǎo)致CHB久治不愈的根本原因。目前，最可靠的cccDNA檢測樣本是肝臟組織，但其獲取及后續(xù)的分離純化難度較大，無法進行動態(tài)觀察。因此，臨床亟需一種能夠反映肝臟內(nèi)病毒感染進程以及監(jiān)測cccDNA活性的替代指標。其他乙型肝炎血清學標志物，如HBV DNA、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎核心相關(guān)抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）被證實與肝細胞內(nèi)cccDNA有關(guān)[3]。然而，目前臨床上以HBV DNA持續(xù)低于檢出下限為停藥指標的患者仍有很高的疾病復(fù)發(fā)率[4]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)血清中存在HBV RNA[5]，這些HBV RNA是包裹在病毒樣顆粒內(nèi)的未經(jīng)或部分逆轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA），其能夠直接獲得病毒外膜并釋放入血，可反映cccDNA活性[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV RNA與HBV DNA、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）均有一定的相關(guān)性，因此或可將血清HBV RNA作為一種新的潛在的指標來監(jiān)測病毒復(fù)制情況和評價藥物療效[8]。目前，國際上尚無標準化的血清HBV RNA檢測方法，本研究對HBV RNA定量檢測試劑盒進行了評估，并探討HBV RNA的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院臨床確診為CHB的患者81例，其中男66例、女15例，年齡25～79歲。接受抗病毒藥物[NA（替諾福韋、恩替卡韋、拉米夫定、阿德福韋酯）]治療者49例，未接受抗病毒藥物治療者32例。所有患者血清HBsAg均為陽性。根據(jù)乙型肝炎血清標志物的不同模式將患者分為4組：第1組，HBeAg和乙型肝炎e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）均為陽性，共20例；第2組，HBeAg陰性、HBeAb陽性，共18例；第3組，HBeAg陽性、HBeAb陰性，共20例；第4組，HBeAg和HBeAb均為陰性、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）為陽性，共23例。排除有肝移植及輸血史的患者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有對象靜脈血，4 h內(nèi)分離血清，置于1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存。

1.2.2 HBV RNA定量檢測 取200 μL血清，使用核酸提取或純化試劑盒（湖南圣湘公司，批號S1006）提取HBV RNA。采用HBV RNA定量檢測試劑盒（湖南圣湘公司）檢測HBV RNA。檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）。PCR擴增體系為50 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；60 ℃ 30 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，共45個循環(huán)；25 ℃ 10 s。60 ℃采集熒光信號。所有檢測結(jié)果必須滿足以下要求：陰性質(zhì)控FAM通道無循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）顯示，VIC通道Ct≤35；陽性對照HBV RNA載量為1.0×104～1.0×106拷貝/mL；4個定量參考品檢測均為陽性，且標準曲線相關(guān)性r2≥0.98。試劑盒檢測線性范圍為1.0×102～1.0×109拷貝/mL。以HBV RNA>1.0×102拷貝/mL為陽性。

1.3 方法學性能驗證

參照中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）發(fā)布的CNAS-GL039：2019《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》進行性能驗證。

1.3.1 精密度 將預(yù)混血清樣本分裝后-20 ℃保存。（1）批內(nèi)精密度。分別在同一批次中對高值（105拷貝/mL）和低值（103拷貝/mL）混合血清樣本重復(fù)提取20次，檢測20次。（2）批間精密度。分別對高值（105拷貝/mL）和低值（103拷貝/mL）混合血清樣本連續(xù)檢測5 d，每天各重復(fù)提取4次、檢測4次，共檢測5批次，總計檢測高值和低值樣本各20份。計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。要求CV≤10%。

1.3.2 靈敏度 使用陰性血清將高值陽性臨床混合血清樣本稀釋至接近試劑盒廠商聲明的檢測下限（1.0×102拷貝/mL），對稀釋后的血清重復(fù)提取并檢測20次，檢測結(jié)果符合陽性判定標準，要求檢出率≥95%。

1.3.3 線性范圍 使用陰性血清對高值陽性樣本（2.20×107拷貝/mL）進行梯度稀釋（1.0×102～1.0×107拷貝/mL），在同一批次中對稀釋樣本進行檢測，每個梯度重復(fù)檢測3次，對測定值進行線性回歸分析，通過計算測定值與理論值的線性相關(guān)系數(shù)得到直線回歸方程Y=bX+a。如滿足b在1±0.05范圍內(nèi)，r2>0.98，則可判定該方法在該濃度范圍內(nèi)成線性。

1.3.4 臨床應(yīng)用評估 采用NATCH-S全自動核酸提取儀（湖南圣湘公司）抽提81例CHB患者血清樣本中的核酸，使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（湖南圣湘公司）在LightCycler 480熒光定量PCR擴增儀（瑞士Roche公司）上定量檢測HBV DNA。PCR擴增體系共50 μL，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃15 s，58 ℃ 30 s，45個循環(huán)；37 ℃ 10 s。線性范圍為5.0×101～5.0×108拷貝/mL。同時使用Elecsys 2010電化學發(fā)光全自動免疫分析儀（瑞士Roche公司）及配套試劑（電化學發(fā)光法）對HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb項目進行半定量檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

對于HBV RNA或HBV DNA低于檢出下限的數(shù)據(jù)，采用單值填補法和左刪失數(shù)據(jù)來表示。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，。2個組之間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Bonfferoni t檢驗。將HBV RNA數(shù)據(jù)進行常用對數(shù)（lg）轉(zhuǎn)換后再進行統(tǒng)計分析。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，線性回歸采用簡單線性回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證

高值、低值樣本的批內(nèi)精密度（CV）分別為0.56%、2.30%，批間精密度（CV）分別為3.13%、6.03%，均符合臨床要求（CV≤10%）。見表1。

表1 精密度驗證結(jié)果

2.2 靈敏度驗證

將高值陽性血清稀釋至接近廠商聲明的檢出限（1.0×102拷貝/mL），重復(fù)提取并檢測20次。20次均能檢出，檢出率為100%，HBV RNA均值為1.300 5×102拷貝/mL，CV為5.70%，與廠商聲明的靈敏度一致。

2.3 線性范圍驗證

實測值與理論值的回歸方程為Y=0.976 9X+0.129 9（r2=0.999 5），表明在HBV RNA 1.0×102～1.0×107拷貝/mL范圍內(nèi)成線性，符合臨床要求。見表2、圖1。

表2 線性范圍驗證結(jié)果

圖1 實測值與理論值的線性關(guān)系

2.4 不同乙型肝炎血清標志物模式患者的HBV RNA載量比較

HBeAg陽性組血清HBV RNA和HBV DNA載量均高于HBeAg陰性組（P＜0.01、P＜0.05）。見表3。

表3 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組血清HBV RNA和HBV DNA載量比較

在不同乙型肝炎血清標志物模式中，第1組血清HBV RNA陽性率為80.0%，第2組為27.8%，第3組為95.0%，第4組為37.5%。除第2組與第4組之間血清HBV RNA載量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）外，其他各組之間血清HBV RNA載量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 不同乙型肝炎血清標志物模式各組HBV RNA載量比較

2.5 治療組與未治療組HBV RNA結(jié)果比較

將49例經(jīng)抗病毒藥物治療的患者歸入治療組，32例未經(jīng)抗病毒藥物治療的患者歸入未治療組。未治療組血清HBV DNA及HBV RNA載量均高于治療組（P＜0.01、P＜0.05），見表4。治療組血清HBV RNA陽性率（57.1%）與未治療組（65.6%）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表4 治療組與未治療組血清HBV RNA和HBV DNA載量比較

2.6 HBV RNA與HBV DNA、HBeAg、HBsAg的相關(guān)性

在81例CHB患者中，HBV RNA水平與HBV DNA載量、HBeAg陽性滴度呈正相關(guān)（r值分別為0.348、0.544，P＜0.05），與HBsAg滴度無相關(guān)性（r=0.040，P>0.05）。在HBeAg陽性的CHB患者中，血清HBV RNA載量與血清HBV DNA載量呈正相關(guān)（r=0.338，P＜0.05）。在HBeAg陰性的CHB患者中，血清HBV RNA載量與血清HBV DNA載量無相關(guān)性（r=0.140，P>0.05）。

3 討論

在HBV生存周期中，以cccDNA為模版逆轉(zhuǎn)錄生成RNA是HBV復(fù)制的開始，也是HBV持續(xù)感染和復(fù)發(fā)的主要原因[9-10]，因此cccDNA是反映體內(nèi)HBV感染和復(fù)制情況最直接的證據(jù)。從慢性HBV感染患者的肝細胞中清除cccDNA是根治CHB的關(guān)鍵[11]。但目前對cccDNA的分析仍主要依靠肝組織活檢，過程復(fù)雜且具有侵入性，因此臨床亟需能反映病毒感染復(fù)制情況、監(jiān)測cccDNA活性的替代標志物。1996年，德國學者K?CK等[5]首次在CHB患者的血清中檢測到HBV RNA。自此，學者們對于HBV RNA的檢測和臨床研究不斷深入。

目前，國際上尚缺乏標準化的血清HBV RNA檢測方法，這是當前HBV RNA研究的一大難題。本研究對湖南圣湘公司的HBV RNA定量檢測試劑盒進行了性能評估。結(jié)果顯示，高值、低值樣本的批內(nèi)精密度（CV）為0.56%、2.30%，批間精密度（CV）為3.13%、6.03%，精密度驗證通過；對接近廠商聲明的檢測下限的樣本重復(fù)檢測20次，檢出率達到100%，靈敏度驗證通過；在HBV RNA 1.0×102～1.0×107拷貝/mL范圍內(nèi)成線性。試劑盒性能均滿足臨床要求，可用于臨床檢測。

本研究結(jié)果顯示，HBeAg陽性組血清HBV RNA和HBV DNA載量均高于HBeAg陰性組（P＜0.01、P＜0.05）。HBV RNA載量在2個組之間差異更為顯著，表明HBV RNA是更靈敏的病毒活動監(jiān)測指標。作為當前應(yīng)用廣泛的乙型肝炎血清標志物，HBV DNA可以提示e抗原的血清學轉(zhuǎn)化[12]。近年來，有研究指出HBV RNA載量對于HBeAg血清學轉(zhuǎn)換有預(yù)測作用[13]。因HBV RNA在HBeAg陽性患者與陰性患者之間有更為顯著的差異，所以HBV RNA或可作為更有效的治療監(jiān)測指標。本研究根據(jù)不同乙型肝炎血清標志物模式對CHB患者進行分組，結(jié)果顯示，HBeAg陽性的2個組（第1組和第3組）HBV RNA載量更高，其中HBeAb同為陽性組（第1組）HBV RNA載量低于HBeAb陰性組（第3組）（P＜0.01），表明HBeAb陽性的CHB患者血清HBV RNA載量低于陰性患者。這是由于HBeAb伴隨HBeAg的消失而出現(xiàn)，其標志著病毒復(fù)制減少、傳染性降低，HBV RNA逆轉(zhuǎn)錄效率降低，導(dǎo)致進入血清中的HBV RNA病毒顆粒減少[14-15]。由此可見，血清HBV RNA可作為一種能更加靈敏且有效地反映病毒復(fù)制過程，提示HBeAg血清學轉(zhuǎn)化的潛在標志物。但本研究未能跟蹤隨訪所有HBeAg陽性患者的血清學轉(zhuǎn)換情況，后續(xù)將完善這方面的研究。

本研究結(jié)果顯示，治療組血清HBV RNA檢出率略低于未治療組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。但未治療組血清HBV DNA和HBV RNA載量均高于治療組（P＜0.01、P＜0.05）。表明血清HBV RNA亦可作為反映患者肝組織內(nèi)病毒活動程度及療效監(jiān)測的指標。

本研究Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，HBV RNA載量與HBV DNA載量、HBeAg陽性滴度呈正相關(guān)（r值分別為0.348、0.544，P＜0.05），與HBsAg滴度無相關(guān)性（r=0.040，P>0.05）；在HBeAg陽性的CHB患者中，血清HBV RNA載量與血清HBV DNA載量呈弱正相關(guān)（r=0.338，P＜0.05）；但在HBeAg陰性的CHB患者中，血清HBV RNA載量與血清HBV DNA載量無相關(guān)性（r=0.140，P>0.05）。既往研究結(jié)果表明，HBV RNA與HBV DNA、HBeAg和HBsAg均有一定程度的相關(guān)性[16]，HBeAg陰性患者HBV RNA與HBV DNA相關(guān)性弱可能是受病毒變異、宿主免疫應(yīng)答或cccDNA表觀遺傳調(diào)控的影響[17-18]。HBsAg與血清HBV RNA無相關(guān)性可能是由于病毒DNA整合于宿主DNA，之后轉(zhuǎn)錄翻譯的HBsAg來自于整合后的核酸而非病毒的cccDNA[19]。本研究得出了幾種指標之間相關(guān)性較低的結(jié)果可能與樣本量較小，結(jié)果分析不夠全面有關(guān)。

綜上所述，血清HBV RNA是能靈敏、有效地反映病毒活動的指標，且與HBV DNA和HBeAg有一定的相關(guān)性，可提示二者的血清學變化。臨床可聯(lián)合HBV RNA、HBV DNA和不同乙型肝炎血清標志物模式綜合分析病毒感染及治療情況[20]，指導(dǎo)用藥與停藥。由于本研究的樣本量較小，且在實際操作過程中HBV RNA極易降解，因此可能對實驗結(jié)果造成了一定的影響，這些因素需在后續(xù)研究中不斷完善與修正?？傊?，血清HBV RNA作為HBV研究領(lǐng)域的新型生物標志物，具有巨大的研究和應(yīng)用價值。