姚鋰?guó)P，鄭巧平，楊 蒙，羅清瓊，陳 旭，陳福祥

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011）

近年來(lái)，多重耐藥耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）的分離率快速升高[1-3]，且可以在院內(nèi)傳播[4]，給臨床抗感染治療和醫(yī)院感染控制帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE的主要耐藥機(jī)制[5]，碳青霉烯酶在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的Ambler結(jié)構(gòu)分類(lèi)中，涉及A類(lèi)（絲氨酸酶）、B類(lèi)（金屬β-內(nèi)酰胺酶）和D類(lèi)[苯唑西林酶（oxaclillinase，OXA）]。目前，全球廣泛流行的是A類(lèi)中的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）[1]，B類(lèi)酶中的新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM）、維羅納亞胺培南酶（Verona imipenemase，VIM）和亞胺培南酶（imipenemase，IMP）[6-7]，以及D類(lèi)中的OXA酶[8]。多中心研究結(jié)果顯示，我國(guó)的CRE菌株主要產(chǎn)KPC酶和NDM酶[9]。有研究結(jié)果顯示，CRE引起的血流感染患者中，約32%在2周內(nèi)死亡[10]，而分析CRE的不同酶型可以為臨床治療提供依據(jù)[11]。早期檢測(cè)CRE并進(jìn)行酶型分析，有助于指導(dǎo)臨床合理用藥，從而提高患者感染后的生存率，并控制其院內(nèi)傳播。目前，用于檢測(cè)碳青霉烯酶的方法有美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(huì)提出的標(biāo)準(zhǔn)改良Hodge試驗(yàn)（modified Hodge test，MHT）、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）、乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（ethylenediaminetetraacetic acid carbapenem inactivation method，eCIM）和Carba NP實(shí)驗(yàn)[12]，以及在此基礎(chǔ)上衍生的Carba NP紙片檢測(cè)[13]、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR[14]和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）[15]等。然而，MHT只能鑒別產(chǎn)酶與否，mCIM和eCIM僅能區(qū)分是否是金屬酶表型，Carba NP實(shí)驗(yàn)則需要昂貴的蛋白抽提液，而PCR、多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR和MALDI-TOF MS步驟繁瑣，并需要相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備。膠體金免疫層析技術(shù)（gold immunochromatography assay，GICA）在過(guò)去的30年中已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，通過(guò)抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物，并利用免疫層析顯色的原理進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需復(fù)雜的操作和專(zhuān)用設(shè)備[16-17]。本研究以PCR為參考方法來(lái)評(píng)估GICA快速檢測(cè)CRE碳青霉烯酶的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2016年1—12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院臨床分離的CRE，采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2 樣本入選標(biāo)準(zhǔn)

CRE菌株根據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心2015年公布的標(biāo)準(zhǔn)[18]進(jìn)行確定：對(duì)任一碳青霉烯類(lèi)不敏感的腸桿菌屬，即對(duì)多利培南、美羅培南或亞胺培南的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 mg/L，或者對(duì)厄他培南的MIC≥2 mg/L，又或者是被證實(shí)為產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌。收集的CRE菌株保存于含30%甘油的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存。菌株復(fù)蘇時(shí)挑取1環(huán)至血平板上培養(yǎng)，第2天再次挑取單個(gè)菌落純化、分離得到復(fù)蘇的菌株。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶型基因 采用簡(jiǎn)化堿裂解法提取細(xì)菌的DNA作為模板，碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA和blaVIM的引物序列[19]見(jiàn)表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用美國(guó)ABI公司GeneAmp 9700 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用上海天能公司Tanon EPS600電泳儀進(jìn)行凝膠電泳后，于Tanon 3500凝膠成像儀上觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov查詢驗(yàn)證為相應(yīng)基因后，作為陽(yáng)性質(zhì)控，每批PCR均設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制。

表1 5種主要碳青霉烯酶基因的PCR引物序列

1.3.2 GICA檢測(cè)碳青霉烯酶 按免疫顯色試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，試劑購(gòu)自北京金山川科技發(fā)展有限公司，具體操作步驟為：（1）準(zhǔn)備1個(gè)無(wú)菌Eppendorf管，滴加10滴樣本處理液；（2）復(fù)蘇保存于-80 ℃冰箱的實(shí)驗(yàn)菌株，挑取復(fù)蘇后的單個(gè)菌落再次純化、分離，用一次性細(xì)菌環(huán)蘸取純化、分離后的1個(gè)克隆菌株，并將該接種環(huán)插入含有樣本處理液的無(wú)菌Eppendorf管；（3）充分?jǐn)嚢瑁谷芤壕鶆?；?）取50 μL稀釋后的樣本加至檢測(cè)卡的加樣孔處；（5）等待10 min后讀取結(jié)果。結(jié)果判讀：出現(xiàn)2個(gè)條帶（檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶）表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；僅出現(xiàn)1個(gè)對(duì)照條帶表明檢測(cè)結(jié)果為陰性；若對(duì)照條帶未出現(xiàn)，則說(shuō)明該檢測(cè)無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)。質(zhì)量控制：質(zhì)控線（C線）為內(nèi)部質(zhì)控，質(zhì)控線不顯色，結(jié)果無(wú)效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對(duì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

共收集到CRE菌株73株，包括64株肺炎克雷伯菌、5株陰溝腸桿菌、2株大腸埃希菌、1株產(chǎn)酸克雷伯菌、1株弗勞地枸櫞酸桿菌。

2.2 酶型基因PCR檢測(cè)結(jié)果

73株CRE經(jīng)酶型基因PCR分析，檢出51株blaKPC陽(yáng)性、19株blaNDM陽(yáng)性、2株blaIMP陽(yáng)性菌、1株blaVIM陽(yáng)性菌株，未檢出blaOXA陽(yáng)性菌株。PCR產(chǎn)物部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 部分PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 GICA檢測(cè)結(jié)果

73株CRE GICA檢測(cè)結(jié)果顯示，blaKPC陽(yáng)性樣本為51例，blaNDM陽(yáng)性樣本為19例，blaIMP陽(yáng)性樣本為2例，blaVIM陽(yáng)性樣本為1例，與酶型基因PCR檢測(cè)結(jié)果一致性為100%。部分碳青霉烯酶類(lèi)型GICA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 部分CRE菌株GICA檢測(cè)結(jié)果

2.4 GICA與酶型基因PCR鑒定結(jié)果比較

將GICA與酶型基因PCR鑒定的blaKPC、blaNDM、blaIMP和blaVIM陽(yáng)性的結(jié)果進(jìn)行比較，以酶型基因PCR檢測(cè)結(jié)果作為檢測(cè)碳青霉烯酶類(lèi)型的參考方法，結(jié)果顯示，GICA檢測(cè)CRE產(chǎn)KPC酶、NDM酶、IMP酶及VIM酶的準(zhǔn)確性均為100%。

3 討論

碳青霉烯類(lèi)作為對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶具有較高穩(wěn)定性的非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染的主要藥物[20]，而碳青霉烯酶對(duì)其具有極高的水解活性，這使得臨床治療CRE感染面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，最終導(dǎo)致了較高的病死率[21]。我國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2020年發(fā)布的報(bào)告顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2018年的25.0%和26.3%，耐藥率上升超過(guò)8倍[22]，所以快速檢測(cè)碳青霉烯酶對(duì)早期監(jiān)測(cè)CRE并預(yù)防其傳播具有重要意義。普通PCR檢測(cè)基因是目前用于確定碳青霉烯酶酶型的金標(biāo)準(zhǔn)，但PCR檢測(cè)過(guò)程中需要菌株純化及DNA提取，平均鑒定時(shí)間約20 h，而GICA無(wú)需菌株DNA提取，挑取單個(gè)菌落后僅需10 min便可讀取結(jié)果，在檢測(cè)的時(shí)間上具有非常大的優(yōu)勢(shì)。作為一種常用的檢測(cè)方法，GICA具有快速、便捷和直觀的特點(diǎn)，可以通過(guò)直接讀取結(jié)果來(lái)分辨KPC、IMP、NDM、VIM和OXA 5個(gè)CRE的主要酶型，可在鑒定產(chǎn)酶的同時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶類(lèi)型進(jìn)行分析，盡早確認(rèn)臨床感染，指導(dǎo)臨床用藥。

本研究共收集到73株CRE，PCR酶型基因檢測(cè)結(jié)果為blaKPC陽(yáng)性51株、blaNDM陽(yáng)性19株、blaIMP陽(yáng)性菌2株、blaVIM陽(yáng)性菌株1株，未檢出blaOXA陽(yáng)性菌株。以PCR檢測(cè)結(jié)果作為檢測(cè)碳青霉烯酶類(lèi)型的參考方法，GICA檢測(cè)CRE產(chǎn)KPC酶、NDM酶、IMP酶、VIM酶的準(zhǔn)確性均為100%。但由于GICA涉及的酶型亞型的局限性，只能檢測(cè)IMP-4，OXA-23和OXA-48型酶，對(duì)于IMP和OXA的其他亞型酶無(wú)法檢測(cè)，會(huì)造成假陰性的結(jié)果[16]。另一方面，本研究中blaIMP、blaVIM及blaOXA陽(yáng)性菌株較少，具有一定的局限性，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步評(píng)估GICA的其他診斷學(xué)參數(shù)。

綜上所述，GICA不僅可以快速檢測(cè)碳青霉烯酶，還可以對(duì)酶型進(jìn)行快速鑒定，步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀，具有較好的臨床應(yīng)用前景，可作為酶型確定和耐藥監(jiān)測(cè)的重要方法，為醫(yī)院感染控制和指導(dǎo)治療提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

致謝：衷心感謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室王院霞老師、唐毅老師、虞中敏老師、方敏老師和孫康德老師在臨床菌種收集方面提供幫助。