延喜勝，雷 磊，王 劍

（1.榆林市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 榆林 718000；2.榆林市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 榆林 718000）

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是人類最為常見(jiàn)的慢性細(xì)菌感染，與胃炎、消化性潰瘍、胃癌等多種慢性胃腸道疾病有關(guān)[1]。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，Hp感染與慢性腎臟衰竭、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A腎病、膜性腎病等腎臟疾病密切相關(guān)[2-3]。目前，Hp感染與早期腎損傷指標(biāo)的關(guān)系尚不明確，Hp不同毒力基因分型與早期腎損傷的關(guān)系及其可能存在的作用機(jī)制也鮮有報(bào)道。本研究旨在分析Hp不同毒力基因與早期腎損傷的關(guān)系及其作用機(jī)制，以期為臨床預(yù)防和早期治療Hp感染相關(guān)腎損傷提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年10月—2019年11月榆林市第一醫(yī)院消化性潰瘍患者504例，根據(jù)是否感染Hp分為Hp（+）組（315例）和Hp（-）組（189例）。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)胃鏡和病理檢查確診為消化性潰瘍；（2）取胃竇部黏膜行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)和13C尿素呼氣試驗(yàn)檢測(cè)，其中1項(xiàng)為陽(yáng)性則為Hp（+），兩者均為陰性判定為Hp（-）；（3）年齡18～70歲；（4）臨床資料完整，依從性高。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近4周內(nèi)服用抗Hp藥物；（2）患有嚴(yán)重心、肺、肝、腦部疾病；（3）依從性差，臨床資料不完整；（4）有胃部手術(shù)史；（5）其他原因引起的早期腎損傷，病理檢查確定為腫瘤。早期腎損傷判定標(biāo)準(zhǔn)：尿視黃醇結(jié)合蛋白（retinol binding protein，RBP）>70 mg/L、尿α1-微球蛋白（alpha1-microglobulin，α1-MG）>12.5 mg/L、尿β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）>3 mg/L、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）>2 mg/L中的1項(xiàng)或1項(xiàng)以上符合。另選取同期健康體檢者100名作為健康對(duì)照組，均為Hp（-），腎功能正常，胃泌素17和13C尿素呼氣試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均正常。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 收集所有對(duì)象年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、消化性潰瘍病程、吸煙史、酗酒史等臨床資料。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 采集所有對(duì)象空腹靜脈血5 mL，同時(shí)收集晨起中段尿10 mL。總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol LDL-C）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)PG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷公司，檢測(cè)儀器為76002全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。采用ADAMS A1c HA-8160全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀（日本愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社）檢測(cè)糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）。采用A15全自動(dòng)特定蛋白分析儀（西班牙BioSystems S.A.公司）及配套試劑檢測(cè)尿白蛋白、尿肌酐及血清尿素（urea，Urea）。尿RBP、尿β2-MG、尿α1-MG、尿TF、血清胱抑素C（cystatin C，Cys C）試劑盒購(gòu)自上海景源醫(yī)療器械有限公司，檢測(cè)儀器為Mission P300特定蛋白分析儀[艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司]。計(jì)算尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin creatinine ratio，UACR）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)高敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、血清IgA1以及蠶豆凝集素（vicia vilosa lectin，VVL）與IgA1鉸鏈區(qū)多肽中絲氨酸或蘇氨酸結(jié)合N-乙酰氨基半乳糖的總結(jié)合力（以VVL-IgA1結(jié)合力表示），試劑盒均購(gòu)自美國(guó)B&D公司。采用99m锝-二乙烯三胺五乙酸（99mtechnetium diethylene triamine penta-acetic acid，99mTC-DTPA）腎動(dòng)態(tài)顯像法檢測(cè)腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerular filtration rate，GFR）。

1.2.3 Hp基因分型檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)Hp 16S rRNA，引物由上海英駿生物科技工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。采用Trizol試劑提取總RNA，采用Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Hp毒力基因cagA、vacA和babA，反應(yīng)條件為30 ℃ 9 min，55 ℃39 min，產(chǎn)物于-80 ℃冰箱中保存待用。PCR擴(kuò)增體系：10×緩沖液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2溶液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP溶液2 μL，0.5 μL Tag DNA聚合酶，2 μL DNA模板，上、下游引物各1.25 μL，加雙蒸水至總體積25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；92 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min。每份樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

表1 Hp不同毒力因子PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，2個(gè)組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多元非線性Logistic回歸分析Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估相關(guān)指標(biāo)診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp（+）組、Hp（-）組及健康對(duì)照組一般資料比較

Hp（+）組RBP、α1-MG、β2-MG、TF、Cys C、hs-CRP、IgA1和VVL-IgA1結(jié)合力與Hp（-）組、健康對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3個(gè)組之間年齡、性別、吸煙史、酗酒史、BMI、尿素、UACR、eGFR差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 Hp（+）組、Hp（-）及健康對(duì)照組一般資料比較

續(xù)表2

2.2 Hp不同毒力基因表達(dá)情況

Hp（+）組cagA、vacA、ureA陽(yáng)性率分別為48.57%（153/315）、64.76%（204/315）、25.08%（79/315）；HP（-）組、健康對(duì)照組cagA、vacA和ureA均為陰性。3個(gè)組Hp不同毒力基因PCR分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3個(gè)組Hp不同毒力基因電泳圖

2.3 早期腎損傷與Hp感染及毒力基因的關(guān)系

2.3.1 Hp（+）組與Hp（-）組早期腎損傷發(fā)生率比較 Hp（+）組早期腎損傷發(fā)生率為18.73%（59/315），高于Hp（-）組[7.41%（14/189）]（χ2=12.227，P=0.000）。

2.3.2 Hp（+）患者早期腎損傷組與無(wú)腎損傷組Hp毒力基因比較 早期腎損傷組cagA+vacA檢出率高于無(wú)腎損傷組（P＜0.05），cagA、vacA、ureA檢出率2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 Hp（+）患者早期腎損傷組與無(wú)腎損傷組Hp毒力基因比較

2.3.3 Hp（+）患者早期腎損傷組與無(wú)腎損傷組各項(xiàng)指標(biāo)的比較 早期腎損傷組病程、RBP、α1-MG、β2-MG、TF、Cys C、hs-CRP、IgA1和VVL-IgA1結(jié)合力均高于無(wú)腎損傷組（P＜0.05），其他指標(biāo)2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

表4 Hp（+）患者早期腎損傷組與無(wú)腎損傷組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

2.4 Hp（+）消化性潰瘍患者早期腎損傷影響因素分析

以Hp感染消化性潰瘍患者是否出現(xiàn)早期腎損傷（是為1，否為0）為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，病程、Cys C、RBP、α1-MG、IgA1、VVL- IgA1結(jié)合力及cagA+vacA陽(yáng)性表達(dá)是Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的影響因素。見(jiàn)表5。

表5 Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷影響因素分析

2.5 各項(xiàng)指標(biāo)診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的效能

以是否發(fā)生早期腎臟損傷為自變量（是為1，否為0），繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，以2.20 g/L為最佳臨界值，IgA1診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的敏感性和特異性分別為76.99%和87.89%，曲線下面積為0.792（95%可信區(qū)間為0.684～0.866）；以3.48 AU/mg為最佳臨界值，VVL-IgA1結(jié)合力診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的敏感性和特異性分別為74.23%和89.43%，曲線下面積為0.773（95%可信區(qū)間為0.673～0.892）。見(jiàn)圖2。

圖2 IgA1、VVL-IgA1對(duì)Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的診斷價(jià)值

2.6 Hp不同毒力基因分型患者腎功能指標(biāo)和炎癥指標(biāo)比較

將59例早期腎損傷患者按照不同毒力基因分型分為cagA+vacA組（30例）和非cagA+vacA組（29例）。cagA+vacA組RBP、α1-MG、Cys C、hs-CRP、VVL-IgA1結(jié)合力與非cagA+vacA組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IgA1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表6。

表6 不同毒力基因分型組腎功能指標(biāo)和炎癥指標(biāo)比較

3 討論

Hp是一種定植于胃腸道的革蘭陰性微需氧細(xì)菌，已被證實(shí)是導(dǎo)致多種慢性胃腸道疾病的常見(jiàn)致病菌，除胃腸道疾病外，Hp感染還涉及心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、血液病、代謝功能障礙的發(fā)生、發(fā)展[4-6]。有研究結(jié)果表明，Hp感染參與了膜性腎病、IgA腎病、紫癜性腎病等多種原發(fā)性腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，Hp感染患者發(fā)生終末期腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非Hp感染患者[7]。另有研究結(jié)果表明，大多數(shù)膜性腎病患者腎小球毛細(xì)血管壁顆粒狀沉積物中出現(xiàn)Hp陽(yáng)性反應(yīng)；Hp感染與糖尿病腎臟病變也存在一定的相關(guān)性[8]。提示Hp感染與早期腎臟病變的關(guān)系較為密切。但Hp感染與早期腎損傷的關(guān)系及作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，Hp（+）消化性潰瘍患者Urea、UACR高于Hp（-）消化性潰瘍患者及健康對(duì)照者，而GFR低于Hp（-）消化性潰瘍患者及健康對(duì)照者，提示Hp感染與早期腎損傷存在一定的關(guān)系，進(jìn)一步提示Hp感染可能參與了早期腎臟病變的發(fā)生、發(fā)展，也證明了盡早根除Hp感染的必要性。

盡管Hp感染與早期腎損傷之間的關(guān)系已經(jīng)有諸多報(bào)道，但Hp不同毒力基因與早期腎損傷之間的關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)。為此本研究將Hp（+）消化性潰瘍患者按是否出現(xiàn)早期腎損傷分為無(wú)腎損傷組和早期腎損傷組，結(jié)果顯示，早期腎損傷組cagA+vacA檢出率明顯高于無(wú)腎損傷組（P＜0.05），提示cagA+vacA共表達(dá)患者早期腎損傷可能更明顯。cagA和vacA作為2個(gè)獨(dú)立的致病因素在胃腸道疾病中發(fā)揮作用，cagA陽(yáng)性表達(dá)可導(dǎo)致胃黏膜多核細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮蛻變[9]，而vacA陽(yáng)性則會(huì)導(dǎo)致胃黏膜修復(fù)功能受損[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，cagA+vacA在胃潰瘍、慢性淺表性胃炎及胃癌患者體內(nèi)的表達(dá)量均高于單一毒力因子[11]，但cagA+vacA對(duì)早期腎損傷是否較單一毒力基因更為明顯尚無(wú)足夠證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，cagA+vacA共表達(dá)患者早期腎損傷發(fā)生率明顯高于單一Hp毒力因子所致的早期腎損傷患者，提示cagA+vacA共表達(dá)對(duì)疾病早期腎臟組織的損傷作用更大，這些毒力因子可表達(dá)于腎臟組織，引起早期腎臟炎癥、氧化應(yīng)激表達(dá)，從而導(dǎo)致早期腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，cagA+vacA導(dǎo)致的早期腎損傷發(fā)生率可能更高，但本研究納入的樣本量不夠大，2個(gè)組之間的差異不明顯，后續(xù)將進(jìn)行大樣本量的多中心研究加以證實(shí)。

有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病伴有微量白蛋白尿患者Hp感染率較正常白蛋白尿患者高，提示Hp感染是導(dǎo)致2型糖尿病患者尿白蛋白升高的原因，其機(jī)制可能是Hp產(chǎn)生的具有抗原性的脂多糖介導(dǎo)了機(jī)體免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)體內(nèi)白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α[12]。Hp感染會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，使C反應(yīng)蛋白和尿白蛋白水平升高[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染患者h(yuǎn)s-CRP、Cys C顯著高于Hp陰性患者，提示Hp感染與機(jī)體炎癥因子高表達(dá)有關(guān)，而炎癥因子的高表達(dá)可能與腎臟早期損傷有關(guān)。為了進(jìn)一步研究Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷與機(jī)體免疫反應(yīng)之間的關(guān)系，本研究納入了IgA1、VVL-IgA1結(jié)合力進(jìn)行分析。IgA1及其免疫復(fù)合物水平在過(guò)敏性紫癜患者急性腎損傷中發(fā)揮作用，其水平越高，早期腎臟損傷越明顯，可能與IgA1半乳糖水平低下有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，Hp（+）消化性潰瘍伴早期腎損傷患者Cys C、hs-CRP、IgA1及VVL-IgA1結(jié)合力均顯著高于無(wú)腎損傷患者，提示Hp感染伴早期腎損傷與機(jī)體免疫反應(yīng)有一定相關(guān)性。為了分析不同毒力基因與機(jī)體免疫反應(yīng)之間的關(guān)系，本研究將59例Hp（+）伴早期腎損傷患者按cagA+vacA表達(dá)與否分為cagA+vacA組和非cagA+vacA組，結(jié)果顯示，2個(gè)組UACR、GFR、Cys C、hs-CRP、VVLIgA1結(jié)合力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），cagA+vacA共表達(dá)患者機(jī)體炎癥反應(yīng)更為明顯。本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示，cagA+vacA陽(yáng)性表達(dá)、IgA1及VVL-IgA1結(jié)合力是Hp感染致早期腎損傷的影響因素（比值比值分別為1.769、2.054、2.442，95%可信區(qū)間分別為1.104～3.536、1.414～6.898、1.753～7.776）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，IgA1及VVL-IgA1結(jié)合力對(duì)Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷有一定的診斷價(jià)值，后續(xù)將進(jìn)一步加大樣本量，研究其在臨床診斷中的作用。

本研究明確了Hp不同毒力基因分型與消化性潰瘍患者早期腎損傷之間的關(guān)系，但未明確Hp感染與早期腎損傷之間的關(guān)系，Hp感染患者出現(xiàn)高比例早期腎損傷與不同毒力基因之間的關(guān)系及作用機(jī)制尚未闡明，且cagA+vacA是否是通過(guò)機(jī)體炎癥反應(yīng)導(dǎo)致消化性潰瘍患者早期腎損傷，需要通過(guò)基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。此外，本研究未分析采用Hp根除法后患者早期腎損傷的發(fā)生情況，后續(xù)將進(jìn)一步分析。

綜上所述，部分Hp感染消化性潰瘍患者會(huì)發(fā)生早期腎損傷，而cagA+vacA共表達(dá)患者早期腎損傷發(fā)生率更高，可能與炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)。