李曉倩，王智慧，池躍朋，王玉紅，謝蘭品，梁亞充

（河北省胸科醫(yī)院結(jié)核二科，河北 石家莊 050041）

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB ）感染導(dǎo)致的肺部炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)為乏力、納差、盜汗、低熱、咳嗽、咳痰等，是常見的肺部感染性疾病。肺結(jié)核發(fā)病率較高，我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，每年新發(fā)結(jié)核病例數(shù)約130萬，且重癥結(jié)核病、結(jié)核病合并獲得性免疫缺陷綜合征等的發(fā)生率越來越高，進(jìn)一步加大了治療難度[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，早期結(jié)核病通過及時(shí)有效的治療，大多數(shù)可以治愈，但是大多數(shù)結(jié)核病患者確診時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，且結(jié)核病治療周期長(zhǎng)[4]，患者配合差等都會(huì)導(dǎo)致患者病死率升高，因此，我國(guó)肺結(jié)核的防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻，及時(shí)確診和有效治療對(duì)于肺結(jié)核的治療有重要意義[5]。目前，肺結(jié)核的診斷主要依靠痰MTB培養(yǎng)、臨床癥狀、影像學(xué)檢查結(jié)果，但某些肺結(jié)核患者會(huì)出現(xiàn)異常的全身或者呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)，極易被誤診或漏診，導(dǎo)致感染的傳播[6]。Xpert MTB/RIF檢測(cè)是一種MTB快速檢測(cè)技術(shù)，具有DNA自動(dòng)提取功能，不僅能明確樣本中是否存在MTB的DNA，而且能明確其是否對(duì)利福平耐藥，且操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，相比于涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法，大大縮短了啟動(dòng)治療的時(shí)間[7]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一類可降解的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶，在炎癥、腫瘤中發(fā)揮重要作用，在肺結(jié)核導(dǎo)致的肺損傷和肺纖維化等病理過程中扮演著重要的角色。γ-干擾素（interferon gamma，INF-γ）是由淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與肺結(jié)核的發(fā)生密切相關(guān)。本研究擬探討MMP-9測(cè)定、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)、IFN-γ釋放試驗(yàn)對(duì)肺結(jié)核的診斷效能。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年5月—2020年5月河北省胸科醫(yī)院200例疑似肺結(jié)核患者，收集患者性別、年齡等一般資料和臨床資料，并根據(jù)檢查結(jié)果分為：（1）菌陽肺結(jié)核組62例，其中男30例、女32例，年齡（51.35±7.27）歲，病程（1.39±0.35）年；（2）菌陰肺結(jié)核組88例，其中男42例、女46例，年齡（50.87±6.84）歲，病程（1.41±0.23）年；（3）非肺結(jié)核組50例，其中男22例、女28例，年齡（50.66±6.15）歲，病程（1.42±0.20）年，包括肺炎20例、肺部感染20例、慢性阻塞性肺疾病10例。3個(gè)組性別、年齡等一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)河北省胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)肺結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，擬診為肺結(jié)核；（2）臨床資料完整；（3）自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾??；（2）合并心、肝、腎等重要臟器功能嚴(yán)重障礙；（3）合并精神疾病，不配合治療、檢查等；（4）入組前3個(gè)月內(nèi)服用激素或免疫抑制劑。

1.3 研究方法

1.3.1 MMP-9、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）及各種免疫活性因子檢測(cè) 采集所有患者入院當(dāng)天空腹靜脈血10 mL，1 000×g離心30 min，靜置后取上清液備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清MMP-9水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abeam公司。采用美國(guó)Beckman Coulter公司IMMAGE 800全自動(dòng)特定蛋白分析儀測(cè)定CRP。采用美國(guó)Genzyme公司Micro全自動(dòng)血沉分析儀測(cè)定ESR，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-15、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-8，試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司，檢測(cè)儀器為Multiakan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。

1.3.2 IFN-γ釋放試驗(yàn) 采集所有患者清晨空腹靜脈血4 mL，肝素抗凝，于1 h內(nèi)平均分裝到N、T和P培養(yǎng)管中，1 mL/管，輕柔混勻后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中垂直放置，培養(yǎng)24 h，隨后1 000×g離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存待測(cè)。采用Multiskan FC酶標(biāo)儀及北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司試劑盒檢測(cè)INF-γ水平，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為450和630 nm。INF-γ>14.0 pg/mL判斷為MTB陽性。

1.3.3 Xpert MTB/RIF檢測(cè) 留取患者的痰、肺泡灌洗液樣本，肺泡灌洗液樣本1 000×g離心10 min，吸棄上清，加入2 mL樣本處理液。痰樣本（1 mL）直接加入2 mL樣本處理液，渦旋震蕩10 s，充分混勻后，采用Xpert MTB/RIF試劑盒（美國(guó)Cepheid公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析，采用四格表法評(píng)價(jià)3種方法診斷肺結(jié)核的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)組臨床資料比較

菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組和非肺結(jié)核組之間婚姻狀況、月收入、文化程度、是否為流動(dòng)人口、戶籍等一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2個(gè)肺結(jié)核組Xpert MTB/RIF陽性檢出例數(shù)（菌陽肺結(jié)核組49例、菌陰肺結(jié)核組69例）明顯高于非肺結(jié)核組（24例，χ2=16.894，P=0.000）。

2.2 3個(gè)組炎癥指標(biāo)比較

菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組患者IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組炎癥指標(biāo)比較

2.3 菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組MMP-9和INF-γ比較

菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組MMP-9、INF-γ水平依次降低，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組MMP-9和INF-γ比較

2.4 菌陽肺結(jié)核組和菌陰肺結(jié)核組INF-γ和Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽性率比較

菌陽肺結(jié)核組和菌陰肺結(jié)核組Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），INF-γ差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組肺結(jié)核組INF-γ、Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽性率比較

2.5 肺結(jié)核影響因素分析

以MMP-9、INF-γ、Xpert MTB/RIF陽性為自變量，以發(fā)生肺結(jié)核為因變量，建立Logistic回歸模型，并賦值Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果（陽性=1，陰性=0），結(jié)果顯示，MMP-9、INF-γ、Xpert MTB/RIF陽性與肺結(jié)核有關(guān)[比值比（odds ratio，OR）值分別為1.687、2.511、1.340，P值分別為0.004、0.005、0.005]。見表4。

表4 肺結(jié)核影響因素分析

2.5 MMP-9、INF-γ釋放試驗(yàn)、Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷肺結(jié)核的價(jià)值

Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷肺結(jié)核的敏感性為86.7%，特異性為90.0%，準(zhǔn)確性為87.5%；INF-γ釋放試驗(yàn)診斷肺結(jié)核的敏感性為80.0%，特異性為62.0%，準(zhǔn)確性為75.5%；MMP-9診斷肺結(jié)核的敏感性為80.7%，特異性為60.0%，準(zhǔn)確性為75.0%；3者聯(lián)合診斷肺結(jié)核的敏感性為90.7%，特異性為78.0%，準(zhǔn)確性為87.5%。見表5。

表5 MMP-9測(cè)定、INF-γ釋放試驗(yàn)、Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷肺結(jié)核的效能

3 討論

肺結(jié)核是我國(guó)常見的慢性傳染性疾病之一，具有高發(fā)病率和高病死率的特點(diǎn)，我國(guó)每年因肺結(jié)核死亡的人數(shù)高達(dá)170萬，隨著病原菌對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥性的進(jìn)一步加強(qiáng)，肺結(jié)核的診治成為臨床亟待解決的難題之一[9-10]。目前，臨床常用的肺結(jié)核診斷方法有支氣管鏡、影像學(xué)檢查和MTB培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測(cè)，在診斷典型肺結(jié)核時(shí)具有較高的敏感性和特異性，但是隨著耐藥菌的產(chǎn)生和獲得性免疫缺陷綜合征患者的不斷增多，非典型性肺結(jié)核的診斷依然面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[11]。因此，尋找敏感性高、特異性強(qiáng)的結(jié)核病診斷方法對(duì)疾病防控至關(guān)重要。

肺結(jié)核的高發(fā)病率與經(jīng)濟(jì)水平和醫(yī)療衛(wèi)生水平相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者收入、文化程度、戶籍等與非肺結(jié)核患者沒有明顯差異，原因可能與本地區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生水平不斷提高，肺結(jié)核的防控工作取得了一定的成果有關(guān)。菌陽肺結(jié)核組、菌陰肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。原因可能是IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR均為非特異性炎癥因子，在感染、腫瘤等多種疾病中均會(huì)升高，對(duì)肺結(jié)核的診斷特異性較差[12]。本研究結(jié)果還顯示，說明MMP-9、INF-γ和Xpert MTB/RIF對(duì)肺結(jié)核均有一定的診斷價(jià)值。2個(gè)肺結(jié)核組Xpert MTB/RIF陽性檢出率、MMP-9和INF-γ水平明顯高于非肺結(jié)核組（P＜0.05）；Logistic回歸分析結(jié)果顯示，MMP-9、INF-γ和Xpert MTB/RIF陽性是肺結(jié)核的影響因素。

Xpert MTB/RIF檢測(cè)同時(shí)采用6種分子探針及6種分子信標(biāo)，可覆蓋rpoB基因上的利福平耐藥決定區(qū)，不僅可以及時(shí)進(jìn)行樣本處理和基因提取，而且可同時(shí)進(jìn)行基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增和熒光檢測(cè)，集樣本前處理、DNA自動(dòng)提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)于一體，具有高特異性、高敏感性、操作簡(jiǎn)單、方便快捷、污染風(fēng)險(xiǎn)小的優(yōu)點(diǎn)，不僅能明確樣本中是否存在MTB的DNA，而且能明確其是否對(duì)利福平耐藥[13-14]。MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶家族成員之一，主要發(fā)揮維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性的作用，在腫瘤、炎癥等情況下，發(fā)揮破壞基膜和溶解細(xì)胞外基質(zhì)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在哮喘小鼠模型的支氣管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，可通過上調(diào)血清類黏蛋白1樣蛋白3基因的表達(dá)，共同參與氣道重塑，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路可誘導(dǎo)大鼠模型肺纖維化[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，MTB可以通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路，誘導(dǎo)MMP-9水平的升高，與胸膜纖維化和胸腔積液相關(guān)，促進(jìn)了肺結(jié)核的發(fā)展[16]。INF-γ主要由T淋巴細(xì)胞分泌，肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫紊亂，INF-γ大量分泌，對(duì)于肺結(jié)核的診斷有一定的參考價(jià)值。INF-γ釋放試驗(yàn)采用模擬MTB蛋白質(zhì)的多肽抗原引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致INF-γ分泌增加，進(jìn)一步通過檢測(cè)INF-γ的分泌水平判斷是否存在MTB感染，是體外試驗(yàn)，且不受卡介苗接種的影響，安全性較高[17]。林永通等[18]通過對(duì)240例疑似肺結(jié)核患者的研究發(fā)現(xiàn)，雖然Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷肺結(jié)核的敏感性有待提高，但特異性較高，且操作簡(jiǎn)便，不需較高的專業(yè)技能，對(duì)肺結(jié)核診斷及利福平耐藥患者的篩查有一定的價(jià)值。廖彥等[19]發(fā)現(xiàn)MTB可通過激活細(xì)胞免疫促進(jìn)MMP-9的高表達(dá)，血清MMP-9水平有助于MTB感染的輔助診斷，且肺結(jié)核患者M(jìn)MP-9增高幅度高于肺癌和肺炎患者，對(duì)肺結(jié)核的鑒別診斷和篩查有一定的臨床意義，但是其敏感性有待提高。王浩等[20]發(fā)現(xiàn)INF-γ釋放試驗(yàn)診斷肺結(jié)核的敏感性和特異性較高，但是檢測(cè)結(jié)果會(huì)受患者免疫功能、感染狀態(tài)、高齡等因素干擾，臨床應(yīng)用價(jià)值有限。本研究發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷肺結(jié)核的敏感性和特異性均較高，INF-γ釋放試驗(yàn)和MMP-9診斷肺結(jié)核的敏感性較高，但特異性較低；而三者聯(lián)合診斷肺結(jié)核的敏感性為90.7%，特異性為78.0%。

綜上所述，MMP-9、INF-γ釋放試驗(yàn)和Xpert MTB/RIF檢測(cè)單項(xiàng)診斷肺結(jié)核均有一定的不足，三者聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷敏感性，有助于早期診斷肺結(jié)核，盡早采取治療措施。