茍 濤，王志勇

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門361021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361021)

0 引言

2020年全國大黃魚(Larimichthyscrocea)養(yǎng)殖總產(chǎn)量25.41萬噸，育苗量約24億尾，均居于我國海水養(yǎng)殖魚類首位[1]。經(jīng)研究，福建和浙江近幾年發(fā)生的大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病，基本上是由惡臭假單胞菌屬的變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)引起的[2-5]。研究者們建立了LAMP等特異性快速檢測方法[6-8],這有利于盡早介入治療。變形假單胞菌引起的大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病對大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了很大的影響。該病在大黃魚各養(yǎng)殖區(qū)廣泛流行，病死率可達(dá)50%以上，病魚體表無明顯癥狀，直到有病死或?yàn)l死的個(gè)體上浮到海面才會被發(fā)覺，此時(shí)網(wǎng)箱中多數(shù)個(gè)體已嚴(yán)重感染，病魚陸續(xù)死亡，嚴(yán)重時(shí)整排網(wǎng)箱的魚幾乎死亡殆盡[9-12]。

基于內(nèi)臟白點(diǎn)病對大黃魚的危害嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)室通過對817尾人工攻毒幼魚進(jìn)行基因組重測序，挖掘獲得近1×107個(gè)SNP，以攻毒后發(fā)病時(shí)間作為抗病力表型值進(jìn)行GWAS分析，精細(xì)定位了抗病相關(guān)區(qū)域，并從上述定位的主效區(qū)域中篩選出1個(gè)抗病相關(guān)基因trim38。trim38是TRIM家族蛋白的一員，該家族蛋白是一類存在于胞漿中、含有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70多個(gè)成員,它們參與細(xì)胞增殖、分化、致癌和程序性死亡等多種細(xì)胞活動。近年的研究[13]表明TRIM蛋白在人和小鼠等物種中具有很重要的抗菌抗病毒功能。2010年，劉新蕾等[14]首次發(fā)現(xiàn)trim38可能作為一個(gè)負(fù)向調(diào)控天然免疫的分子，trim38可以通過與RIG-1相互作用抑制其與下游效應(yīng)分子IPS-1、TBK1的結(jié)合，從而對于干擾素信號通路起到負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。trim38可以激活NF-κB的宿主蛋白[15-17]。trim38可以促進(jìn)K63和K48相關(guān)的細(xì)胞蛋白泛素化，可在病毒感染過程中被降解[18]。2014年，胡明明等[19]發(fā)現(xiàn)trim38是腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)觸發(fā)信號的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子。

本研究克隆了大黃魚trim38基因的ORF序列全長，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在大黃魚不同組織的表達(dá)情況以及經(jīng)變形假單胞菌感染后不同時(shí)間的表達(dá)情況，為闡明大黃魚在應(yīng)對變形假單胞菌感染過程中的抗病機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用大黃魚于2019年2月采集于福建省寧德市金鈴水產(chǎn)科技有限公司，體重為(28.0±8.0)g。攻毒前，所有魚在水溫18℃，鹽度25左右的條件下馴養(yǎng)1周。動物實(shí)驗(yàn)操作遵循集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院動物倫理委員會的要求進(jìn)行。

人工攻毒實(shí)驗(yàn)所用變形假單胞菌菌株分離于自然發(fā)病魚，由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院鄢慶枇教授惠贈。攻毒前，將-80℃條件下保存的菌株復(fù)蘇并接種于含2%NaCl的LB液體培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床中180 r/min、37℃培養(yǎng)至OD值A(chǔ)600為1.0左右。用紫外可見分光光度計(jì)測量菌液濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA Kit)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMreverse transcription system protocol，promega)購自上海泰京生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司；高保真酶(2×Phanta?Max Master Mix)、一步克隆試劑盒(ClonExpress?II One Step Cloning Kit)和熒光定量染料(ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物由廈門鉑瑞生物科技有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大黃魚樣品采集

組織表達(dá)譜分析：從暫養(yǎng)群體中隨機(jī)選取6個(gè)正常個(gè)體,用丁香酚麻醉后，將魚體置于冰上，用75%酒精擦拭體表，依次剪取鰓、鰭條組織；隨后立即將魚體解剖，依次取脾臟、肝臟、腸、腎臟和頭腎組織；最后沿大黃魚頭部中線剪開，采集腦組織。將所有樣品放置于RNA保護(hù)液中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

變形假單胞菌攻毒實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)至1.0×109CFU/mL的變形假單胞菌菌液均勻潑灑到攻毒實(shí)驗(yàn)池(池子面積4 m×2 m×0.8 m,水深20 cm)中，至池中菌液終濃度為1.0×106CFU/mL，使細(xì)菌與魚充分接觸，并保留一部分不予以攻毒的魚作為對照組。細(xì)菌感染過程持續(xù)3 h之后，將所有攻毒實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)移到裝有潔凈曝氣海水的池子中，維持攻毒前的水溫和鹽度繼續(xù)養(yǎng)殖，分別在攻毒后3,6,12,24,48,72,96,120 h，在對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)從攻毒組隨機(jī)撈取6尾大黃魚，用丁香酚麻醉后快速解剖取其腎臟、脾臟和肝臟，置于RNA保護(hù)液中，保存在-80 ℃的冰箱中備用。

1.3.2 總RNA提取及cDNA的合成

采用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取大黃魚組織樣品及經(jīng)變形假單胞菌感染后的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈。用大黃魚管家基因β-actin檢測反轉(zhuǎn)錄效果。引物見表1。

表1 本研究中使用的引物

1.3.3 大黃魚trim38基因的克隆

從本實(shí)驗(yàn)室的大黃魚基因組測序數(shù)據(jù)庫中獲得trim38基因的開放閱讀框(ORF)序列，據(jù)此設(shè)計(jì)trim38-F/R引物(序列見表1)，以大黃魚腎臟cDNA為模板擴(kuò)增trim38。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收并連接入pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落送到廈門鉑瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序，以驗(yàn)證序列結(jié)構(gòu)。用DNAMAN軟件對測序結(jié)果和參考序列進(jìn)行比對分析，并使用Primer Premier 5.0軟件(http://www.premierbiosoft.com)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物qtrim38-F/R(序列見表1)。

1.3.4 大黃魚trim38基因的生物信息學(xué)分析

在網(wǎng)站http://Web.expasy.org/cgi-bin/protparam上分析蛋白質(zhì)的物理參數(shù)；在網(wǎng)站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/上預(yù)測信號肽；用DNAMAN軟件分析序列同源性；在網(wǎng)站http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi上預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域；用BioEidt軟件做氨基酸多重序列比對；用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)trim38 cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qtrim38-F/R，用稀釋50倍的cDNA為模板，選擇大黃魚β-actin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR(引物序列見表1)，按照熒光定量染料ChamQTMniversal SYBR?qPCR Master Mix說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系：ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix 10.0 μL，qtrim38-F/R各0.5 μL，cDNA模板4.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。在StepOnePlus 熒光定量PCR儀(美國 Application Biosysterms 公司)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

對實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)樣品目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 trim38基因的結(jié)構(gòu)

克隆獲得大黃魚trim38基因ORF長度為1623 bp，編碼540個(gè)氨基酸(見圖1)，蛋白理論大小為61.58 ku，等電點(diǎn)6.99。SignaIP-5.0 Server和TMHMM Server V.2.0預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM38蛋白沒有信號肽和跨膜區(qū)。

NetPhos 3.1 Server預(yù)測出TRIM38蛋白含有58個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括36個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，14個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn),8個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(見圖1)。通過SMART預(yù)測表明，TRIM38蛋白從N端到C端依次排列，分別含有1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域、1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PRYSPRY結(jié)構(gòu)域(見圖2)。表2為大黃魚與其他物種trim38氨基酸序列比較分析結(jié)果，從表2中可見，黃姑魚trim38基因與大黃魚trim38基因同源性最高，為86.86%；其次是棘頭梅童魚(84.96%)和鱖魚(68.63%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3)分析結(jié)果顯示，魚類和哺乳類的trim38各自聚為一支，大黃魚trim38與黃姑魚的親緣關(guān)系最近。

表2 大黃魚與其他物種trim38氨基酸序列的同源性分析

2.2 trim38基因在不同組織的表達(dá)分析

以大黃魚β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大黃魚trim38基因在鰓、鰭、頭腎、腦、脾、肝、腸和腎共八個(gè)組織/器官中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。大黃魚trim38基因在腎臟中相對表達(dá)量最高，其次為肝臟和頭腎,在其他組織中的相對表達(dá)量較低。

2.3 trim38基因在經(jīng)變形假單胞菌感染后不同時(shí)間的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大黃魚trim38基因經(jīng)變形假單胞菌感染0，3，6，12，24，48，72，96，120 h后的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示。在變形假單胞菌攻毒后，trim38在大黃魚肝臟與脾臟中的相對表達(dá)量迅速提升。在肝臟3 h的相對表達(dá)量就達(dá)到高峰且達(dá)對照組的5.7倍，其后迅速下降，12 h后又逐漸增高，72 h時(shí)約增加到開始時(shí)的3.0倍，形成1個(gè)次高峰，其后又逐漸下降。在脾臟中，攻毒后3 h相對表達(dá)量迅速增加到開始時(shí)的4.2倍，其后略有下降，但一直維持在開始時(shí)的2倍乃至3倍以上，在120 h又大幅度增加到開始時(shí)的6.8倍，達(dá)到峰值。在腎臟中3 h的相對表達(dá)量顯著降低，6 h之后恢復(fù)至正常水平，其后在起始值的0.5～1.3倍之間波動，在96 h達(dá)到最大值，為起始時(shí)的1.3倍。

3 討論

本研究首次克隆出大黃魚trim38開放閱讀框(ORF)全長，其ORF長度為1623 bp，編碼540個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為6.99。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,trim38具有TRIM家族的主要特征：RING結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域和PRYSPRY結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次排列。RING結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)蛋白泛素化[21]，可以激活RIG-I信號通路；B-box結(jié)構(gòu)域能結(jié)合鋅離子；PRYSPRY結(jié)構(gòu)域的功能是介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用[22]。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)魚類和哺乳類的trim38各自聚為一支。大黃魚trim38基因與同屬于石首魚科的黃姑魚和棘頭梅童魚trim38基因同源性較高，與哺乳動物trim38基因同源性相對較低。這可能是因?yàn)椴煌锓N所處環(huán)境不同，面對不同的環(huán)境選擇壓力，導(dǎo)致不同的進(jìn)化速度和進(jìn)化方向[23]。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，trim38基因的mRNA廣泛分布于所檢測的大黃魚8種組織或者器官中，在腎臟中相對表達(dá)量最高，其次為肝臟和頭腎。說明大黃魚trim38基因在免疫相關(guān)組織中高度表達(dá)。其同家族基因在大黃魚中也有類似的作用，例如周真真等[24]報(bào)道，大黃魚TRIM25蛋白在肝臟和頭腎相對表達(dá)量高。腎臟和肝臟是魚類的重要免疫器官，上述結(jié)果提示trim38在大黃魚免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TRIM蛋白家族具有很重要的抗菌抗病毒功能，在病毒感染的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[25-26]。如trim38通過靶向TRIF降解負(fù)性調(diào)節(jié)TLR3介導(dǎo)的IFN-β信號[27]。TRIM25泛素化可通過正調(diào)控激活I(lǐng)RF1促使IFN-β的產(chǎn)生，且能顯著激活RIG-I信號通路上的RIG-I和MAVS等基因的上調(diào)。TRIM25泛素化激活發(fā)揮了抗病毒作用[28]。TRIM37可能通過抑制Wnt/β-catenin通路從而抑制腫瘤的生產(chǎn)[29]。TRIM22在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可以通過激活PI3K/AKT信號通路和EMT過程來推動腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[30]。本研究大黃魚感染變形假單胞菌后主要的病變組織器官是脾臟、肝臟和腎臟。在脾臟中，攻毒3 h后相對表達(dá)量迅速增加到開始時(shí)的4.2倍，其后略有下降，但一直維持在開始時(shí)的2倍乃至3倍以上，到高表達(dá)后仍持續(xù)表達(dá)，在120 h又大幅度增加到開始時(shí)的6.8倍，達(dá)到峰值。該基因在脾臟中表達(dá)顯著，可能與脾臟作為大黃魚應(yīng)對變形假單胞菌感染的主要靶器官有關(guān)[3、31]。在肝臟，攻毒3 h時(shí)相對表達(dá)量就達(dá)到高峰，達(dá)對照組的5.7倍，其后迅速下降，12 h后又逐漸增高，72 h時(shí)約增加到開始時(shí)的3.0倍，形成1個(gè)次高峰，然后又逐漸下降。在腎臟中，攻毒3 h時(shí)相對表達(dá)量降低，3 h之后相對表達(dá)量上升，在96 h達(dá)到最大值，為起始時(shí)的1.3倍。初步推測大黃魚trim38基因有可能參與了大黃魚抗內(nèi)臟白點(diǎn)病的免疫應(yīng)答。

蛋白質(zhì)泛素化與許多重要的生命過程有密切關(guān)系，現(xiàn)已知道其參與信號傳導(dǎo)、細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等等。研究發(fā)現(xiàn)，trim38是一種天然免疫調(diào)節(jié)劑[32]。作為負(fù)調(diào)控因子，trim38蛋白介導(dǎo)賴氨酸48(K48)連接的TNF受體相關(guān)因子6、TRIF和NF-κB激活激酶相關(guān)蛋白1的泛素化，促進(jìn)其蛋白酶體降解，從而抑制TLR和RLR通路。此外，trim38促進(jìn)溶酶體依賴的TAK1結(jié)合蛋白2(TAB2)在TNF和IL-1b觸發(fā)的信號中降解，不依賴于它的E3泛素連接酶活性[18]。

但是，關(guān)于trim38基因在大黃魚應(yīng)對變形假單胞菌感染的免疫應(yīng)答過程中行使怎樣的功能，以及具體的免疫抗病機(jī)制，還需進(jìn)一步的研究闡明。本文為深入研究trim38基因在大黃魚應(yīng)對變形假單胞菌感染的抗病免疫機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。