魏 璐，田建華，史 鵬

(山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

沙棘(Hippophaerhamnoides)，胡頹子科灌木或喬木，別名醋柳，是極為珍貴的藥食同源植物，主要分布于歐亞大陸的溫帶高山區(qū)[1]。原花青素是沙棘的主要生物活性成分之一，具有多種生理功能[2,3]。筆者采用鹽酸-正丁醇法對(duì)沙棘籽不同部位的原花青素含量進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)其對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除效果，分析評(píng)價(jià)其抗氧化性，以期為沙棘資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料包括沙棘原料(購(gòu)自山西省某沙棘飲料廠)、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥95%，成都曼斯特生物科技有限公司)、甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨。

試驗(yàn)儀器包括JYL-C020E粉碎機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司)、Explorer pro分析天平(奧豪斯儀器有限公司)、HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)、KQ-200VD型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、UV3100PC紫外-可見分光光度計(jì)(美普達(dá)儀器有限公司)、SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

用簸箕從沙棘原料中分出沙棘籽、沙棘籽殼、提油沙棘籽渣(經(jīng)超臨界CO2萃取)，分別于-50 ℃用冷凍干燥機(jī)干燥24 h，粉碎，過(guò)80目篩，備用。

1.2.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置濃度為0 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各1 mL，置于安瓿瓶中，加入鹽酸-正丁醇溶液6 mL、硫酸鐵銨溶液0.2 mL，混勻，用封口鉗將其密封，于沸水中加熱40 min后取出，立即置于冰水中冷卻至室溫，于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，顯色在1 h內(nèi)穩(wěn)定。以吸光度為縱坐標(biāo)，原花青素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 原花青素含量測(cè)定

精密稱取樣品10 mg～100 mg，置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，離心或靜置澄清后取上清液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液1 mL，置于安瓿瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟執(zhí)行，以只加鹽酸-正丁醇溶液和硫酸鐵銨溶液為空白對(duì)照。測(cè)定樣品吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中原花青素的含量，計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中原花青素的含量，g/100 g；c為反應(yīng)混合物中原花青素的量，μg/mL；V為待測(cè)樣液總體積，mL；V1為樣液反應(yīng)體積，mL；V2為樣液反應(yīng)后總體積，mL；m為試樣質(zhì)量，mg。

1.2.4 原花青素抗氧化性測(cè)定

1)DPPH自由基清除能力測(cè)定。取不同濃度的原花青素提取液1.0 mL，加入0.004%的DPPH溶液3 mL，充分混勻，在黑暗條件下靜置30 min，以無(wú)水乙醇作空白對(duì)照，相應(yīng)濃度的VC和BHT作陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品3次重復(fù)，取平均值。計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=(A2-A1)/A2×100%。

式中：A1為樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度，A2為空白對(duì)照的吸光度。

2)羥自由基清除能力測(cè)定。于比色管中分別加入7.5 mmol/mL硫酸亞鐵溶液1 mL、7.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，再加入不同濃度待測(cè)原花青素提取液1 mL，最后加0.8 mol/L過(guò)氧化氫溶液1 mL，35 ℃條件下水浴35 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照以蒸餾水取代原花青素提取液,本底測(cè)試以蒸餾水取代過(guò)氧化氫，以VC和BHT作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算公式如下：

羥自由基清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；Ax為樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度；Ax0為本底測(cè)試的吸光度。

3)超氧陰離子清除能力測(cè)定。在比色管中加入0.05 mol/L的Tris-HCl溶液(pH值為8.2)4.5 mL，于25 ℃下水浴保溫20 min，加入不同濃度的原花青素提取液0.1 mL和3 mmol/L的鄰苯三酚(用10 mmol/L的HCl配置)0.5 mL，混勻后于20 ℃條件下水浴6 min，再加入2滴8 mol/L的HCl終止反應(yīng)，于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照以蒸餾水取代原花青素提取液，本底測(cè)試以蒸餾水取代鄰苯三酚，以VC和BHT作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算公式如下：

超氧陰離子清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度，A1為樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度，A2為本底測(cè)試的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.004 6x-0.018 7，其相關(guān)系數(shù)R2=0.994 1。

2.2 沙棘籽不同部位原花青素含量

沙棘籽不同部位原花青素含量見第6頁(yè)圖2。

由圖2可知，沙棘籽不同部位原花青素含量不同。原花青素含量最高的部位是沙棘籽殼，含量為66%；其次為沙棘籽，含量為45%；提油沙棘籽渣的原花青素含量最低，僅為8%左右。這是由于在超臨界CO2萃取過(guò)程中，沙棘籽渣中的大部分原花青素隨夾帶劑被萃取，僅有少量留在殘?jiān)小?/p>

圖2 沙棘籽不同部位原花青素含量

2.3 沙棘籽不同部位原花青素的抗氧化能力

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素對(duì)DPPH自由基的清除能力見圖3。

圖3 沙棘籽不同部位原花青素對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖3可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都有清除DPPH自由基的作用。3種原花青素提取液在10 μg/mL時(shí)已經(jīng)具有清除DPPH自由基的能力，隨著提取液濃度的增大，其對(duì)DPPH自由基的清除率也增大。當(dāng)提取液濃度增大至某一值時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值。當(dāng)提取液濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，3種樣品原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率和VC相近，約為95%左右。3種樣品處于同一濃度時(shí)，其原花青素對(duì)DPPH自由基的清除能力為提油沙棘籽渣>沙棘籽殼>沙棘籽，這是由于不同樣品中原花青素的聚合度不同。同常見的抗氧化劑相比，沙棘籽不同部位原花青素對(duì)DPPH的清除效果弱于VC，強(qiáng)于BHT。

2.3.2 對(duì)羥自由基的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素對(duì)羥自由基的清除能力見圖4。

圖4 沙棘籽不同部位原花青素對(duì)羥自由基的清除能力

由圖4可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都具有清除羥自由基的作用。其中，沙棘籽殼原花青素提取液對(duì)羥自由基的清除率呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)提取液濃度由20 μg/mL增長(zhǎng)至600 μg/mL時(shí)，清除率由53%增加至90%，且沙棘籽殼原花青素提取液對(duì)羥自由基的清除率明顯高于VC和BHT。沙棘籽和提油沙棘籽渣中原花青素對(duì)羥自由基的清除率僅在低濃度下呈現(xiàn)一定的增長(zhǎng)，當(dāng)濃度增加至100 μg/mL后趨于平緩，沙棘籽原花青素的羥自由基清除率維持在21%～31%，提油沙棘籽渣原花青素的羥自由基清除率維持在34%～45%，兩者對(duì)羥自由基的清除效果均強(qiáng)于BHT，弱于VC。

2.3.3 對(duì)超氧陰離子的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素對(duì)超氧陰離子的清除能力見圖5。

圖5 沙棘籽不同部位原花青素對(duì)超氧陰離子的清除能力

由圖5可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都有清除超氧陰離子的作用，清除效果隨濃度的增加而增加。樣品和陽(yáng)性對(duì)照在濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除效果相近，清除率約為10%～20%；濃度為0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除效果相差較大。沙棘籽殼原花青素的超氧陰離子清除率可達(dá)68.9%，高于其余樣品和陽(yáng)性對(duì)照，沙棘籽、提油沙棘籽渣原花青素的超氧陰離子清除率約為43%～53%，低于VC，高于BHT。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，沙棘籽不同部位的原花青素含量為沙棘籽殼>沙棘籽>提油沙棘籽渣。沙棘籽不同部位原花青素均具有清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的能力，且清除能力在一定范圍內(nèi)和樣品濃度呈正相關(guān)關(guān)系，清除效果優(yōu)于常見的抗氧化劑BHT，但稍弱于VC，其中，沙棘籽殼中原花青素對(duì)羥自由基和超氧陰離子的清除效果優(yōu)于VC?？傮w而言，沙棘籽中的原花青素具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，該資源的開發(fā)利用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。