劉景玉

（光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)中心，上海 200436）

檸檬明串珠菌（Leuconostoccitreum）是從谷物和蔬菜（如酸面團(tuán)、酸菜和泡菜）發(fā)酵中分離出來的革蘭氏陽性乳酸菌[1]。檸檬明串珠菌作為食品用發(fā)酵劑的使用日益普遍。基于培養(yǎng)和宏基因組的泡菜微生物區(qū)系分析表明，檸檬明串珠菌是泡菜發(fā)酵早期和中期的優(yōu)勢微生物，因此可用作發(fā)酵劑[2-3]。2008年，Kim等[4]報(bào)道檸檬明串珠菌的全基因組序列，該菌是從低溫發(fā)酵的韓國泡菜中分離出的名為檸檬明串珠菌KM20的菌株，它可以抑制病原微生物的生長，如蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、藤黃微球菌、銅綠假單胞菌和血清型鼠傷寒沙門氏菌。目前NCBI共收錄33 個(gè)檸檬明串珠菌的全基因組數(shù)據(jù)，平均G+C含量約為40%，平均基因組大小約為1.9 Mb，并且多個(gè)菌株中包含有至少1 個(gè)質(zhì)粒[5]。

細(xì)菌胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）是由細(xì)菌合成的結(jié)構(gòu)多樣的生物聚合物，具有物理化學(xué)和功能特性，使它們成為微生物合成的重要產(chǎn)物，具有廣泛和多功能的生物技術(shù)潛力[6]。檸檬明串珠菌產(chǎn)生的EPS有右旋糖酐、交替葡聚糖、果聚糖、菊粉等，它們的結(jié)構(gòu)如圖1所示[7]。右旋糖酐是由D-葡萄糖以α-1,6糖苷鍵連接的主線性鏈葡聚糖[8]，由右旋糖酐蔗糖酶（dextransucrase，DS）催化產(chǎn)生。DS屬于細(xì)胞外酶、細(xì)胞結(jié)合酶或二者兼有，取決于不同的菌株來源[9]。DS是大型酶，分子質(zhì)量為64～184 kDa[10-12]，催化的反應(yīng)是以蔗糖為底物產(chǎn)生葡聚糖和果糖單糖。交替葡聚糖是一種支鏈葡聚糖，具有獨(dú)特的交替α-1,3和α-1,6-D-糖苷鍵主鏈結(jié)構(gòu)，由交替蔗糖酶催化蔗糖底物反應(yīng)產(chǎn)生[13]。果聚糖是直鏈主鏈中含有β-2,6糖苷鍵的多糖，偶爾具有β-2,1糖苷鍵分支點(diǎn)，而菊粉則相反（主鏈中含β-2,1糖苷鍵，分支點(diǎn)為β-2,6糖苷鍵）[14-15]。果聚糖蔗糖酶（levansucrase，LS）負(fù)責(zé)將蔗糖底物轉(zhuǎn)化為果聚糖和葡萄糖，已報(bào)道的LS分子質(zhì)量通常較小，為45～64 kDa[16]。葡聚糖和果聚糖都具有廣泛的特性，主要取決于它們的連接模式，盡管在某些方面有所不同，但為它們在許多領(lǐng)域，特別是在食品工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)中的通用應(yīng)用提供了合適的先決條件[17-18]。

圖1 4 種同型多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Schematic chemical formulae of four extracellular homopolysaccharides

目前已有多個(gè)國內(nèi)外課題組報(bào)道了檸檬明串珠菌所產(chǎn)生的EPS結(jié)構(gòu)。Bounaix等[8]從多株檸檬明串珠菌的產(chǎn)物中鑒定出產(chǎn)生的葡聚糖。Abid等[19]從檸檬明串珠菌BMS中分離出在第3位分支的α-1,6-葡聚糖和β-2,6-果聚糖。Han Jin等[20-21]報(bào)道，檸檬明串珠菌BD1707在番茄汁中可以將蔗糖底物轉(zhuǎn)化為果聚糖。表1總結(jié)了目前已報(bào)道的部分檸檬明串珠菌菌株與它們對(duì)應(yīng)的EPS產(chǎn)物類型?，F(xiàn)有的大部分報(bào)道都鑒定出EPS結(jié)構(gòu)，但是對(duì)應(yīng)催化這些EPS產(chǎn)生的酶卻研究較少。本研究旨在探索檸檬明串珠菌BD1707菌株中可能催化果聚糖產(chǎn)生的相關(guān)酶，建立酶與產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

表1 部分檸檬明串珠菌產(chǎn)生的EPS及其相關(guān)合成酶Table 1 EPS and related synthases produced by some strains of L. citreum

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬明串珠菌BD1707，本實(shí)驗(yàn)室分離自藏靈菇，現(xiàn)已保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC6431）。

MRS培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基另加1.5%～2.0%瓊脂）、葡萄糖、蔗糖（均為分析純） 德國Merck公司；硫酸銨、醋酸鈉、氯化鈣（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)超快染色液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；surePAGETM非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）預(yù)制膠（4%～20%） 南京金斯瑞生物科技有限公司；20×MOPS、5×Native Loading、20×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline ，PBS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker 1610374 美國Biorad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TE612-L電子天平、BSA124S-CW電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Milli-Q超純水儀 默克化工技術(shù)（上海）有限公司；Avanti J-30I落地式離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；TOMY-SX-70全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；17R高速離心機(jī)、Orion 3 STAR pH計(jì) 美國Thermo Scientific公司；SW-CJIBU超凈工作臺(tái) 蘇州蘇凈集團(tuán)；FreeZone 12真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；RH-KT/C磁力攪拌器 德國IKA公司；Mini-PROTEIN 3 system電泳儀 美國Bio-Rad公司；850離子色譜儀（配備919自動(dòng)進(jìn)樣器） 瑞士萬通公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄汁培養(yǎng)基的制備

將新鮮番茄榨汁，離心（9 000 r/min、4 ℃、20 min）后用紗布過濾；濾液加熱到微沸，冷卻后離心（9 000 r/min、4 ℃、20 min），將上清液用5 mol/L NaOH調(diào)至pH 6.8，用作種子發(fā)酵液；實(shí)驗(yàn)組加2 g/100 mL蔗糖，調(diào)至pH 6.8，對(duì)照組加2 g/100 mL葡萄糖，調(diào)至pH 6.8，分裝后118 ℃滅菌15 min。番茄榨汁得率約為0.9 L/kg。用接種環(huán)挑取單菌落接種到100 mL種子培養(yǎng)基中，28 ℃搖床180 r/min過夜培養(yǎng)18 h，分別按5%接種量加入到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，28 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)24、72 h[20]。

1.3.2 蛋白沉淀和處理

收集1.3.1節(jié)培養(yǎng)后的發(fā)酵液和菌體，離心（9 000 r/min、4 ℃、20 min）；菌體用pH 7.5的PBS懸浮后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，超聲功率300 W，單次破碎時(shí)長5 s，間歇時(shí)長5 s，工作總時(shí)長30 min，處理完畢后，離心（12 000 r/min、4 ℃、20 min），取上清得到酶液。向發(fā)酵液和菌體破碎液上清中分別緩慢加入研磨的硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，待硫酸銨全部溶解后再繼續(xù)攪拌30 min，使溶液中硫酸銨的飽和度分別達(dá)到20%、40%、60%、80%、100%；4 ℃過夜，離心（18 000 r/min、4 ℃、20 min），沉淀用適量純水復(fù)溶；復(fù)溶的蛋白用15 kDa透析袋在0.1 g/100 mL CaCl2溶液中透析24 h，透析袋中的液體凍干保存。

1.3.3 原位反應(yīng)

稱量5 mg凍干樣品，溶于0.5 mL PBS中，離心（12 000 r/min、4 ℃、10 min）取上清，得蛋白樣品。將Native Loading與蛋白樣品混合后，用4%～20%的Native-PAGE預(yù)制膠在110 V電壓下電泳80 min。得到的蛋白膠一半用考馬斯亮藍(lán)染色，另一半用pH 5.5、20 mmol/L NaAc溶液洗脫至少2 次后，置于含5 g/100 mL蔗糖的pH 5.5、20 mmo/L NaAc溶液中（加入0.03 g/100 mL的NaN3溶液防止染菌），30 ℃恒溫放置48 h后在暗室觀察原位反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.4 膠內(nèi)產(chǎn)物及單糖組成分析

取少量膠內(nèi)提取的產(chǎn)物a、b、c和蔗糖、葡萄糖標(biāo)品點(diǎn)樣于薄層層析（thin-layer chromatograhpy，TLC）硅膠板，然后置于展開劑（乙腈∶乙酸乙酯∶異丙醇∶蒸餾水=5.0∶1.0∶2.5∶1.0，V/V）中展層，約25 min后取出，霧噴顯色劑后于120 ℃烘箱中烘5 min，糖斑點(diǎn)顯色較明顯后進(jìn)行掃描拍照。

單糖組成分析：向產(chǎn)物a、b、c中分別加入1 mol/L鹽酸溶液，100 ℃水解2 h，水解液中加入CaCO3中和至不冒泡；樣品離心（12 000 r/min、4 ℃、10 min）后，對(duì)水解單糖進(jìn)行測定。離子色譜條件：安培脈沖檢測器；色譜柱：Carb1柱（4×250 mm）；流動(dòng)相：15 mmol/L NaOH；等梯度洗脫，流速1 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；進(jìn)樣盤溫度4 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Chemdraw 17.0軟件和Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀分析

對(duì)檸檬明串珠菌BD1707發(fā)酵24 h的發(fā)酵液和菌體破碎液上清進(jìn)行飽和硫酸銨分級(jí)沉淀，離心后的沉淀溶解后進(jìn)行Native-PAGE原位活性初步測試。由表2可知，60%飽和度條件下，硫酸銨沉淀的蛋白樣品活性測試得到的對(duì)應(yīng)產(chǎn)物條帶最亮，40%飽和度條件下，硫酸銨沉淀的蛋白樣品活性測試表明能得到少量產(chǎn)物，而飽和度高于60%和低于20%時(shí)，硫酸銨沉淀的蛋白樣品活性測試幾乎看不到產(chǎn)物條帶。表明硫酸銨飽和度達(dá)到60%時(shí)，需要的活性蛋白能被完全沉淀出來。因此選用飽和度60%硫酸銨作為活性蛋白的最終提取條件。在細(xì)胞裂解液中未看到明顯的產(chǎn)物產(chǎn)生，表明細(xì)胞內(nèi)沒有活性蛋白，目標(biāo)蛋白在細(xì)胞外。

表2 飽和硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白的初步原位活性測試結(jié)果Table 2 Results of in situ activity tests of proteins precipitated with ammonium sulfate

2.2 Native-PAGE蛋白電泳分析

對(duì)檸檬明串珠菌BD1707大量發(fā)酵24 h和72 h后，將發(fā)酵液硫酸銨飽和度為60%時(shí)沉淀收集的蛋白樣品用含4%～20%聚丙酰胺的Native-PAGE膠進(jìn)行電泳檢測。蛋白膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，由圖2A可知，經(jīng)過上述步驟后得到的蛋白混合物中，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組在約150 kDa處多出一條明顯的條帶，并且實(shí)驗(yàn)組24 h與72 h樣品均出現(xiàn)該條帶，而對(duì)照組則沒有出現(xiàn)該條帶。表明蔗糖能在番茄汁中誘導(dǎo)檸檬明串珠菌BD1707產(chǎn)生150 kDa大小的蛋白并分泌到胞外。在接近100 kDa的位置，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有明顯的蛋白條帶，該條帶較寬，可能含有多種蛋白，不能直接從染色膠圖中看出差異。150 kDa處的蛋白是否具有聚合活性還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，已有報(bào)道中鮮有發(fā)現(xiàn)該分子質(zhì)量的果聚糖聚合酶，葡聚糖蔗糖酶和菊粉蔗糖酶已有與該分子質(zhì)量接近甚至分子質(zhì)量更大的蛋白被報(bào)道[11,22]。由于之前的報(bào)道中檸檬明串珠菌BD1707產(chǎn)生的胞外多糖是果聚糖[20]，因此推測該蛋白可能是一個(gè)新型果聚糖蔗糖酶。

圖2 Native-PAGE分析結(jié)果Fig. 2 Results of native-PAGE analysis

2.3 原位活性測試分析

由圖2B、C可知，在暗室觀察原位活性測試48 h的蛋白膠，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)3 條明顯的半透明條帶，而對(duì)照組則沒有出現(xiàn)，這些新出現(xiàn)的條帶為被固定在Native-PAGE膠上的酶催化蔗糖底物產(chǎn)生的多糖。其中a條帶對(duì)應(yīng)的酶分子質(zhì)量約為150 kDa，推測可能對(duì)應(yīng)圖2A中的考馬斯亮藍(lán)染色條帶，而b、c條帶對(duì)應(yīng)的酶分子質(zhì)量約為90、80 kDa，未能在圖2A對(duì)應(yīng)的位置看到明顯的考馬斯亮藍(lán)染色條帶，可能是由于背景雜蛋白掩蓋，或者是該蛋白含量未達(dá)到蛋白膠檢測限。上述3 個(gè)大小的蛋白從培養(yǎng)24 h樣品中開始出現(xiàn)，到培養(yǎng)72 h依然存在，且產(chǎn)物條帶亮度相似，表明在酸性條件下它們的穩(wěn)定性較高，發(fā)酵后期的pH值接近4.0[20]。

以上結(jié)果表明，通過60%飽和硫酸銨沉淀的發(fā)酵液中的蛋白具有聚合活性，這3 個(gè)不同大小的酶均能利用蔗糖作為底物產(chǎn)生多糖。由于之前的報(bào)道中檸檬明串珠菌BD1707產(chǎn)生的EPS是果聚糖[20]，因此推測3 個(gè)蛋白合成的都是果聚糖。

2.4 多糖產(chǎn)物的單糖組成分析

由圖3可知，通過TLC檢測可以發(fā)現(xiàn)，Native-PAGE蛋白膠上條帶a、b、c對(duì)應(yīng)的多糖產(chǎn)物a、b、c均不能在TLC板中展開，而標(biāo)品葡萄糖和蔗糖均能展開，表明a、b、c均為分子質(zhì)量較大的多糖產(chǎn)物且不含寡糖和單糖等小分子，從TLC檢測結(jié)果無法看出多糖產(chǎn)物a、b、c的結(jié)構(gòu)區(qū)別。

圖3 產(chǎn)物TLC分析Fig. 3 TLC analysis of products

為了增加檢測的準(zhǔn)確性，將多糖產(chǎn)物a、b、c一起水解，用分析柱檢測其單糖組成。由圖4可知，與果糖標(biāo)品對(duì)比，3 種多糖酸解后的單糖為果糖，表明它們均為果聚糖，與Han Jin等[20]的報(bào)道和之前的推測一致。由于提取的多糖產(chǎn)物a、b、c含量較少，無法判斷它們的聚合度和結(jié)構(gòu)差異。

圖4 原位活性產(chǎn)物的單糖組成分析Fig. 4 Analysis of monosaccharide composition of in situ active product

3 結(jié) 論

檸檬明串珠菌BD1707在含蔗糖的番茄汁中能產(chǎn)生果聚糖，但是與之相關(guān)的合成酶鮮有研究。本研究通過飽和硫酸銨分級(jí)沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硫酸銨飽和度為60%時(shí)能將檸檬明串珠菌BD1707番茄汁發(fā)酵液中的活性蛋白完全沉淀下來，并且合成多糖的活性蛋白存在于細(xì)胞外。Native-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組多出一條明顯的分子質(zhì)量150 kDa的蛋白條帶。Native-PAGE膠原位活性測試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉淀出的蛋白能產(chǎn)生3 個(gè)聚合條帶，分子質(zhì)量最大約為150 kDa，另外2 個(gè)分子質(zhì)量接近90、80 kDa，表明檸檬明串珠菌BD1707的番茄汁發(fā)酵液中含有3 種分子質(zhì)量不同的果聚糖蔗糖酶。TLC和單糖組成分析進(jìn)一步確定了不同分子質(zhì)量的蛋白合成產(chǎn)物a、b、c都是果聚糖，目前還不能確定這3 個(gè)產(chǎn)物在聚合度和結(jié)構(gòu)上是否有差異，3 個(gè)蛋白的分子質(zhì)量比目前已報(bào)道的果聚糖蔗糖酶分子質(zhì)量要大，可能是果聚糖蔗糖酶家族的新成員。本研究初步確立了檸檬明串珠菌BD1707產(chǎn)生的果聚糖與其合成酶的對(duì)應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)果聚糖蔗糖酶的酶活研究提供了參考。