楊曉君 梅博 韓奕奕

（上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708）

巴比妥類藥物（barbiturates）是一種安眠鎮(zhèn)靜藥物，通常作為化學(xué)保定劑和鎮(zhèn)靜藥物用于動物臨床，可引起近似生理性睡眠，臨床表現(xiàn)主要為抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)（包括血管運動中樞和延腦呼吸中樞）[1]。但是，由于巴比妥類藥物存在致癌、致畸等毒性作用，長時間食用帶有其殘留的動物制品，容易造成藥物積累，嚴重危害人類健康。因此，許多國家和地區(qū)禁止將巴比妥類藥物用于人和動物[2-3]。據(jù)文獻報道，目前，分析巴比妥類藥物的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前巴比妥類藥物檢測的首選方法，其應(yīng)用范圍廣泛。例如，張峰[4]等建立了超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜快速檢測方法，并對動物飼料中違禁添加的巴比妥類藥物進行了測定，樣品經(jīng)甲醇提取、C18固相萃取柱凈化后進行檢測，3種化合物的檢出限為0.20 mg/kg，回收率為62%～85%；田懷香[5]等采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了生鮮乳中4種巴比妥類藥物殘留，樣品經(jīng)乙腈提取、SPE柱凈化后進行檢測，4種藥物殘留的檢出限為5 ng/g，回收率為85.0%～113.5%。

筆者分析已有的研究成果發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外報道的巴比妥類藥物檢測方法大多是針對人的血液、尿、胃內(nèi)容物和豬肉、豬肝中的藥物殘留及其代謝產(chǎn)物，目前，將此方法應(yīng)用到生鮮乳中巴比妥類藥物殘留檢測的研究較少。因此，建立一種生鮮乳中巴比妥類藥物殘留的檢測方法，具有極其重要的意義，不僅能健全和完善相關(guān)的標準體系，還可規(guī)范原奶的生產(chǎn)技術(shù)，從而促進生鮮乳行業(yè)整體質(zhì)量水平的提高。在此背景下，筆者研發(fā)了一種能快速、靈敏、特異性強地檢測生鮮乳中7種巴比妥類藥物（巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥和硫噴妥）的方法，并對該方法所涉及的提取、凈化、定性條件、定量條件等進行了優(yōu)化，以期加強生鮮乳行業(yè)質(zhì)量監(jiān)控，切實保護奶農(nóng)和消費者的利益?，F(xiàn)將相關(guān)研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)藥品和試劑

化學(xué)藥品和試劑包括：乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司），超純水（Milli-Q系統(tǒng)生產(chǎn)），PSA吸附劑（天津博納艾杰爾科技有限公司），無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉（分析純，德國M e r c k默克)，巴比妥（Barbital）、苯巴比妥（Phenobarbital）、戊巴比妥（Pentobarbitone）、異戊巴比妥（Amobarbital）、仲丁比妥（Butabarbital）、司可比妥（Secobarbital）、硫噴妥（Pentothal）的標準品純度不低于95%（天津阿爾塔科技有限公司）。

標準貯備液制備：準確移取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫噴妥的標準品各1.00 mL，分別用甲醇定容至10.00 mL，配制成濃度為10 μg/mL的標準貯備液，然后在2～8 ℃的環(huán)境下冷藏保存，有效期為3個月。

混合標準中間液制備：準確移取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫噴妥的貯備液各1 mL，用甲醇定容至10.00 mL，該混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫噴妥的濃度均為1 μg/mL，在2～8 ℃環(huán)境下冷藏保存，有效期為1個月。

1.2 儀器和條件

Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Agilent公司），ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（規(guī)格為150 mm×3.0 mm，粒徑1.8 μm，美國Agilent公司）。

液相色譜條件：柱溫為35 ℃；進樣體積為5μL；流速為0.4 mL/min；A路流動相為水，B路流動相為乙腈，流速及梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

質(zhì)譜檢測條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；毛細管電壓為3.5 kV；噴嘴電壓為500 V；干燥氣溫度為200 ℃；鞘氣溫度為250 ℃；掃描方式為負離子掃描；檢測方法為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣流量為14 L/min；鞘氣流量為11 L/min；霧化器工作壓力為35 psi；定性離子對、定量離子對、碰撞能量加速電壓參數(shù)均見表2。

表2 7種巴比妥類藥物的質(zhì)譜檢測條件和保留時間

1.3 實驗方法

經(jīng)對檢測方法所涉及的提取、凈化、定性條件、定量條件等進行優(yōu)化（優(yōu)化結(jié)果見2.1），得到最終檢測方法如下。

1.3.1 樣品前處理

提?。簻蚀_稱取生鮮乳樣品10.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入乙腈20 mL，高速渦旋混勻20 min，然后加入6 g復(fù)合沉淀劑（無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉按質(zhì)量比8∶2∶2∶1混合而成），立即渦旋混勻約30 s，于8 000 rpm條件下離心10 min，取上清液備用。

凈化：吸取提取液約8 mL于已加入1 g復(fù)合吸附劑（無水硫酸鎂、PSA按質(zhì)量比6∶1混合而成）的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s后，于10 000 r/min條件下離心5 min。取上清液于eppendorf管內(nèi)，用水定容至1 mL，充分混勻后經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.2 標準溶液的制備

將空白樣品按樣品提取步驟進行前處理，取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、仲丁比妥、司可比妥、硫噴妥標準溶液,用空白樣品提取液分別配成2、5、10、20、50、100 ng/mL的基質(zhì)混合標準工作溶液，供上機測定。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，顯著性為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法優(yōu)化

2.1.1 提取試劑優(yōu)化

本實驗比較了甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈4種提取試劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇對蛋白的沉淀效果不好；乙酸乙酯和三氯甲烷雖能較好地提取極性較弱的巴比妥類藥物，但是由于生鮮乳中的脂肪、蛋白、磷脂含量較高，導(dǎo)致提取過程中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；乙腈不僅能完全提取生鮮乳中的巴比妥類藥物，還能起到較好的沉淀蛋白作用，且在酸性條件下，在乙腈溶液中再加入氯化鈉、硫酸鎂等沉淀劑，可通過增加水相比重，有效將巴比妥類藥物全部轉(zhuǎn)移到乙腈層。因此，本實驗選擇乙腈作為提取試劑。

2.1.2 固相吸附劑優(yōu)化

本實驗比較了不凈化、活性炭凈化、C18凈化、普通凈化的凈化效果，4種固相吸附劑的組分見表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以普通的無水硫酸鎂+PSA組合的凈化效果最好，回收率最高，結(jié)果見圖1。

表3 4種固相吸附劑組分比較

圖1 不同凈化方式的巴比妥類藥物回收率

2.1.3 液相色譜柱的選擇和洗脫程序優(yōu)化

本實驗比較了以甲醇-水和乙腈-水為流動相時7種巴比妥類藥物的質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動相時，7種巴比妥類藥物的質(zhì)譜響應(yīng)更好，故本實驗采用乙腈作為流動相中的有機相。同時，本實驗還比較了以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時7種巴比妥類藥物的離子對信號強度的影響，結(jié)果表明，當水相中加入0.1%甲酸時，僅有硫噴妥的離子對信號強度增強，其他6種巴比妥類藥物的離子對信號強度均減弱，故最終本實驗選擇乙腈-水作為流動相進行試驗。

巴比妥類藥物殘留檢測中常用的色譜柱有C18和HSS PFP色譜柱，本實驗以水-乙腈為流動相，比較了7種巴比妥類藥物在兩種色譜柱上的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7種巴比妥類藥物在C18柱上的峰形、響應(yīng)信號明顯優(yōu)于HSS PFP色譜柱，見圖2。故本實驗選擇C18液相色譜柱進行試驗。同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)，柱溫會影響待測物的保留時間和峰型，表現(xiàn)為柱溫越高，出峰越快，保留時間越小，且峰型變窄，分離度增大。為滿足檢測條件，最終本實驗選擇柱溫為35 ℃。

圖2 7種巴比妥類藥物總離子流圖

2.2 方法驗證

筆者對優(yōu)化形成的同時檢測生鮮乳中7種巴比妥類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的線性關(guān)系、準確度、精密度進行驗證。

2.2.1 線性關(guān)系和檢出限

在2～100 ng/mL濃度范圍，7種巴比妥類藥物的相關(guān)系數(shù)均大于0.995 0，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。同時，在樣品中添加最低檢出限相當濃度的標樣，以驗證該方法的靈敏度，發(fā)現(xiàn)該方法對生乳中巴比妥類藥物的檢出限為10 μg/kg，方法靈敏度高，可用于痕量分析。具體結(jié)果見表4。

表4 線性關(guān)系、檢出限、相關(guān)系數(shù)和濃度范圍

2.2.2 準確度、精密度

在樣品添加濃度為20～100 ng/mL時，巴比妥的回收率為81.2%～95.9%，苯巴比妥的回收率為81.9%～94.3%，仲丁比妥的回收率為88.6%～96.3%，戊巴比妥的回收率為93.2%～99.2%，異戊巴比妥的回收率為89.0%～99.5%，司可比妥的回收率為93.1%～98.2%，硫噴妥的回收率在79.9%～82.1%，表明該方法可實現(xiàn)較高的回收率，滿足檢測要求。見表5。

表5 7種巴比妥類藥物殘留的加標回收準確度實驗結(jié)果

在樣品添加濃度為20 ng/mL時進行重復(fù)性試驗，巴比妥的變異系數(shù)為3.11%，苯巴比妥的變異系數(shù)為3.58%，仲丁比妥的變異系數(shù)為2.86%，戊巴比妥的變異系數(shù)為4.28%，異戊巴比妥的變異系數(shù)為3.07%，司可比妥的變異系數(shù)為4.41%，硫噴妥的變異系數(shù)為4.27%，表明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。見表6。

表6 7種巴比妥類藥物殘留的加標回收精密度實驗結(jié)果

根據(jù)方法學(xué)驗證的要求，組織上海市食品研究所、上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所、上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心等單位對本方法進行驗證試驗，并對生鮮乳中7種巴比妥類藥物的殘留量進行再現(xiàn)性試驗。結(jié)果表明，重復(fù)性變異系數(shù)在2.56%～4.55%，再現(xiàn)性變異系數(shù)在 2.87%～4.69%。

結(jié)合上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心生鮮乳質(zhì)量安全與日常保障項目，收集來自上海及其周邊地區(qū)牧場的生鮮乳樣品98批次，運用該方法進行7種巴比妥類藥物殘留的風(fēng)險排查工作。經(jīng)檢測，98批次生鮮乳樣品中均未檢出巴比妥類藥物殘留，且試驗過程中加標質(zhì)控樣的回收率在80.4%～95.6%。以上結(jié)果說明，上海及其周邊地區(qū)的牧場在奶牛生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，嚴格遵守了國家相關(guān)法規(guī)，均沒有違禁使用巴比妥類藥物。

3 結(jié)論與討論

筆者研發(fā)了一種能快速、靈敏、特異性強地檢測生鮮乳中7種巴比妥類藥物（巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥和硫噴妥）的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法具有較好的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性，此方法檢出限為10 μg/kg，回收率為79.9%～99.5%，回收率試驗變異系數(shù)≤7.58%，重復(fù)性試驗變異系數(shù)≤4.41%。同時，本方法采用QuEChERS前處理技術(shù)，相較于傳統(tǒng)凈化過柱方法，縮短了60%以上的操作時間，可做到批量測定。因此，該方法具有較好的應(yīng)用前景。

值得注意的是，該方法中前處理樣品的稀釋倍數(shù)較高，因此宜適當降低稀釋倍數(shù)，并提高上機液濃度，從而提高該方法的靈敏度，以適應(yīng)更低濃度的精確定量要求。