別福升 任愛山 徐華琴 王金虎 劉雪靜 朱東建＊,

(1棗莊學(xué)院，魯南煤化工工程技術(shù)研究院，棗莊 277160)

(2賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，賀州 542899)

伴隨工業(yè)的發(fā)展，大量重金屬離子被排放到自然環(huán)境當中，成為一類重要的污染物。重金屬離子能夠在動植物體內(nèi)富集，并沿食物鏈累積，對人類造成重大危害，引發(fā)各種疾病[1]。在諸多重金屬離子中，銀離子由于毒性較低而容易被忽視。低濃度的銀離子是有益的，可消炎殺菌、除臭、促使傷口愈合，對抑制某些細菌、真菌和病毒等有較好的效果，研究表明安全又有效的濃度為10 mg·L?1[2]。但銀離子在體內(nèi)富集到一定濃度后會引起中毒，導(dǎo)致視力下降、癲癇等[3-4]。

因此，對銀離子快速定性或定量檢測分析具有非常重要的意義。對銀離子的經(jīng)典檢測方法包括原子吸收光譜[5]、電感耦合等離子體光譜[6]和電化學(xué)[7]等。這些方法在樣品制備和測試條件方面要求嚴格、程序繁瑣，且儀器昂貴，而熒光分析法以其較高的靈敏度、方便操作、低成本和易于原位測量等特點發(fā)展迅速[8]。

目前科研工作者們設(shè)計了多種不同類型的熒光探針分子用于銀離子的識別[9-10]，如香豆素類[11-12]、萘酰亞胺類[13]、羅丹明類[14-15]、氟硼二吡咯類[16-17]等。咔唑類雜環(huán)化合物以其良好的化學(xué)穩(wěn)定性、較高的熒光量子產(chǎn)率和易于修飾等優(yōu)點，廣泛作為化學(xué)傳感器的熒光團[18]。冠醚是一類高柔韌性的配體，可形成有效的金屬離子螯合物。當冠醚中氧原子被替換為硫原子或氮原子時，其對金屬離子如銀的配位能力會顯著提高[19]。我們結(jié)合以上優(yōu)點，設(shè)計、合成了一種新型熒光探針分子，以穩(wěn)定且有優(yōu)異光物理性質(zhì)的N-乙基咔唑為熒光團、高配位能力的單氮二硫雜冠醚為識別基團，實現(xiàn)了對銀離子的選擇性識別。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器包括紫外可見分光光度計(UV-2401，日本島津公司)、熒光分光光度計(F-4600，日本日立公司)、超導(dǎo)核磁共振儀(AVANCE NEO 400，400 MHz，瑞士布魯克公司)、液相色譜?串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(Agilent 6530，美國安捷倫公司)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，OPTIMA 8000DV，PerkinElmer)、實驗室臺式pH計(PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器公司)。

實驗所用藥品和試劑均為市售分析純，實驗用水為超純水。

1.2 熒光探針分子L的合成與表征

L的合成路線如圖1所示。

圖1 探針L的合成路線Fig.1 Synthetic route of probe L

1.2.1 中間體1的合成

在1 L三口瓶中加入碳酸銫(2.18 g，6.7 mmol)和500 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在2個恒壓滴液漏斗中分別加入雙(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.30 g，5.4 mmol)和 2，2-(乙烷-1，2-二丁基(氧基))二乙硫醇(0.98 g，5.4 mmol)，分別用 100 mL DMF 溶解。置換氬氣后升溫至50℃，2個恒壓滴液漏斗內(nèi)的溶液同時緩慢滴加至三口瓶中，滴完后繼續(xù)攪拌2 h。減壓過濾，濾液蒸干溶劑DMF后再加入乙酸乙酯(EA)溶解。水洗(5×20 mL)后再用飽和NaCl溶液洗滌(20 mL)，無水Na2SO4干燥，蒸干EA后得粗產(chǎn)物。將其柱層析得無色油狀物0.98 g，產(chǎn)率52%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 3.73(t，J=5.1 Hz，4H)，3.59(s，4H)，3.49～3.36(m，4H)，2.86～2.79(m，4H)，2.68(t，J=5.2 Hz，4H)，1.41(s，9H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 155.2，79.7，73.9，73.8，70.6，49.2，48.8，31.7，31.5，31.5，31.1，28.4。

1.2.2 中間體2的合成

在50 mL三口瓶中加入N-乙基咔唑(0.6 g，3.1 mmol)、1.1 mL DMF、8 mL氯苯，冰水浴冷卻后加入三氯氧磷(0.95 g，6.2 mmol)，反應(yīng) 30 min?；謴?fù)室溫，反應(yīng)30 min。然后升溫至70℃，反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，用飽和Na2CO3溶液洗滌。二氯甲烷(DCM)萃取(3×20 mL)，無水 Na2SO4干燥，蒸干 DCM后得粗產(chǎn)物。柱層析得0.54 g白色固體，產(chǎn)率78%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 10.14(s，1H)，8.64(d，J=1.7 Hz，1H)，8.38(d，J=7.7 Hz，1H)，8.11(d，J=8.6 Hz，1H)，8.02(d，J=8.0 Hz，1H)，7.62(d，J=8.6 Hz，1H)，7.37(t，J=7.8 Hz，1H)，4.44(q，J=7.2 Hz，2H)，1.45(t，J=7.2 Hz，3H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 191.5，145.5,136.8，132.0，130.3，128.9，127.9，125.7，123.9，123.6，122.6，119.8，110.5，41.4，14.4。

1.2.3 熒光探針L的合成

在50 mL單口瓶中加入中間體1(0.60 g，1.71 mmol)，用5 mL DCM溶解后加入1.0 mL三氟乙酸，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，加入飽和Na2CO3溶液至pH=7～8，用DCM萃取(3×20 mL)，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸干溶劑后的固體直接用于下一步反應(yīng)。

將上述粗產(chǎn)物放入50 mL單口瓶中，稱量0.38 g中間體 2(1.7 mmol)，加入10 mL 1，2-二氯乙烷，攪拌10 min。分批加入三乙酰氧基硼氫化鈉(0.43 g，2.0 mmol)，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，用1 mol·L?1鹽酸調(diào) pH=4～5。再用1 mol·L?1氫氧化鈉溶液中和至pH=7～8。EA 萃取(3×20 mL)，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸干EA，柱層析得白色固體0.33 g，產(chǎn)率 42%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 8.09(d，J=8.6 Hz，1H)，8.03(s，1H)，7.45～7.43(m，2H)，7.39(d，J=8.0 Hz,1H)，7.34(d，J=8.2 Hz，1H)，7.23～7.20(m，1H)，4.36(q，J=8.0 Hz，2H)，3.83(s，2H)，3.78(t，J=7.8 Hz，4H)，3.66(s，4H)，2.85(s，8H)，2.74(t，J=7.8 Hz，4H)，1.43(t，J=7.2 Hz，3H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 140.2,139.3，129.5，126.9，125.5，122.8，122.8，120.7，120.5,118.7,108.4，108.2，73.5，70.9，60.2，53.9，37.6，31.3，30.1，13.9。HR-MS(ESI-TOF)[M+H]+C25H35N2O2S2：m/z計算值459.213 5，實驗值459.214 0。

1.3 溶液配制與光譜測量

探針L儲備溶液用二甲基亞砜溶解配制，濃度為1.0 mmol·L?1。各種金屬離子鹽儲備溶液均用超純水溶解，濃度 5.0 mmol·L?1。在 5 mL 容量瓶中加入探針L儲備液0.025 mL，再加入一定體積的金屬離子儲備液，用水/乙醇(4∶1，V/V)稀釋至刻度，搖勻后測定光譜。熒光光譜所選激發(fā)波長為300 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。掃描波長范圍為320～550 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針L對Ag+的識別

首先考察探針L在不同pH值(5.0～9.0)的熒光發(fā)射光譜。記錄358 nm處熒光光譜的變化，可發(fā)現(xiàn)在pH=6～8時，探針L的熒光發(fā)射光譜變化較小(圖2A)，因此選擇在中性條件下測試該探針對金屬離子的識別。然后利用熒光光譜測試探針L對不同金屬離子的選擇性識別性能。如圖2B所示，5μmol·L?1探針L在358和374 nm處有強的熒光發(fā)射峰。向探針溶液中加入7.5 μmol·L?1的Ag+后，探針分子的熒光發(fā)生顯著猝滅。而在同等測試條件下，向探針溶液中分別加入 7.5 μmol·L?1的其他金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Cd2+、Ce2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Al3+、Fe3+)，并沒有使探針 L的熒光強度發(fā)生顯著的變化。這表明探針L具有選擇性識別Ag+的能力。

圖2 (A)探針L的熒光發(fā)射光譜在358 nm處的熒光發(fā)射強度隨pH變化圖;(B)探針L及其加入各種不同金屬離子后的熒光光譜圖Fig.2 (A)Fluorescence intensity changes of probe L at 358 nm with pH;(B)Fluorescence spectra of L and L with various metal ions

隨后考察該探針對Ag+檢測的抗干擾能力。首先，配制5 μmol·L?1探針L溶液，再將10 μmol·L?1不同金屬離子分別加入探針L溶液中，測量熒光光譜并記錄358 nm處熒光發(fā)射峰強度。然后將10μmol·L?1的Ag+分別加入上述金屬離子的溶液中，再次測量熒光光譜并記錄358 nm處熒光發(fā)射峰強度，所得結(jié)果如圖3所示。從結(jié)果可以得出，探針L對Ag+的選擇性識別，基本不受實驗所加入的其他金屬離子干擾。

圖3 探針L及其加入10μmol·L?1不同金屬離子(紅色柱)后再加入10 μmol·L?1Ag+(黑色柱)的熒光強度的柱狀圖Fig.3 Fluorescence intensity histograms of probe L and L with various metal ions with concentration of 10 μmol·L?1(red bar)and then added 10 μmol·L?1Ag+(black bar)

2.2 探針L對Ag+滴定實驗

首先通過紫外吸收光譜滴定實驗測試了探針L與Ag+的相互作用。沒有加入Ag+時，探針L在270和300 nm處存在最大吸收峰。隨著Ag+濃度增加，270 nm處最大吸收峰減弱，300 nm處最大吸收峰增強(圖4A)。然后研究了探針L對Ag+的熒光光譜滴定實驗。向探針L(5 μmol·L?1)的溶液中滴加Ag+，隨著Ag+濃度增加，358和374 nm處的熒光強度逐漸減弱(圖4B)，推測Ag+與探針L配位作用時發(fā)生了反向光致電子轉(zhuǎn)移過程，導(dǎo)致熒光猝滅。如圖4C所示，378 nm處的熒光強度在Ag+濃度為0～4.5 μmol·L?1范圍內(nèi)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系(y=?2 055.07x+2 201.69，R2=0.991 2)，利用檢出限(LOD)計算公式[20]LOD=3σ/k(σ為測定10次空白值的標準偏差，k為校正曲線的斜率)，計算探針L對Ag+的檢測限是4.13 μmol·L?1。我國污水綜合排放標準中第一類污染物最高允許排放濃度對Ag+的限量要求為4.64 μmol·L?1[21]，探針L檢測Ag+的檢出限可滿足該要求。

如圖 4C 所示，加入約 5.0 μmol·L?1Ag+后 358 nm處光譜基本不再變化，繼續(xù)加入Ag+(6.0～20μmol·L?1)，熒光強度基本維持穩(wěn)定，這說明探針L和Ag+的配位比可能為1∶1。Job′s plot實驗結(jié)果也驗證了1:1的配位比(圖5)。高分辨質(zhì)譜(ESI-TOF)測得探針L與Ag+配合物的式量為565.110 5(C25H34AgN2O2S2，計算值為 565.110 7)，進一步驗證了其1∶1的配位比。根據(jù)熒光滴定曲線數(shù)值，利用Benesi-Hildebrand方程[22]得到探針L與Ag+的配位常數(shù) Ka為 2.01×105L·mol?1(線性擬合方程為 y=4.96×10?6/Ka+4.097×10?6，R2=0.964)。

圖4 (A)探針L滴加Ag+(0～20 μmol·L?1)后紫外吸光度的變化圖;(B)探針L滴加Ag+(0～20 μmol·L?1)后熒光光譜的變化圖;(C)探針L在358 nm處熒光強度隨Ag+濃度改變的變化圖Fig.4 (A)UV absorbance changes of probe L with addition of Ag+(0-20 μmol·L?1);(B)Fluorescence specta changes of probe L with various addition of Ag+(0-20 μmol·L?1);(C)Fluorescence intensity changes at 358 nm of probe L with various concentrations of Ag+

圖5 探針L與Ag+配位作用的Job′s plotFig.5 Job′s plot for coordination of L with Ag+

我們推測探針L對Ag+的識別機理是N，S-雜冠醚通過離子?偶極作用對Ag+的整體配位(圖6A)[23]。利用密度泛函理論(DFT)進一步研究其配位方式。在B3LYP/6-31G/LANL2DZ(Ag)計算水平下，對配位結(jié)構(gòu)進行構(gòu)型優(yōu)化，得到探針L對Ag+的結(jié)合能為?565.72 kJ·mol?1，并給出部分結(jié)構(gòu)參數(shù)(圖 6B)。優(yōu)化結(jié)果表明探針L和Ag+通過1∶1方式配位，這與Job′s plot實驗和高分辨質(zhì)譜結(jié)果一致。Ag—O和Ag—N鍵長在0.248～0.255 nm的正常鍵長范圍內(nèi)，而Ag—S鍵長在0.277～0.279 nm，作用較弱。以上所有計算由Turbomole和ChemShell 3.7.0.5進行[24]。

圖6 (A)探針L對Ag+的可能識別機理;(B)DFT方法優(yōu)化的L-Ag配位結(jié)構(gòu)Fig.6 (A)Proposed recognition mechanism of probe L to Ag+;(B)Optimized geometry of L-Ag by DFT method

2.3 探針L對環(huán)境水樣中Ag+的檢測

取河水和自來水用濾膜進行簡單過濾雜質(zhì)后配制 0.5 mmol·L?1的 Ag+待測液。然后依次取 1.6、2.4、4.0μL的待測液加入到2 mL探針L溶液中進行熒光光譜測試。檢測結(jié)果列于表1中。探針L對Ag+檢測的回收率分別為94.0%～102.5%和97.0%～103.3%，檢測結(jié)果具有較高準確性。同時將待測樣品用ICP測定相應(yīng)Ag+濃度，發(fā)現(xiàn)測試結(jié)果與熒光檢測所得數(shù)值基本一致，因此證明探針L可以應(yīng)用于環(huán)境水樣中的Ag+檢測。

表1 環(huán)境水樣中探針L對Ag+的檢測結(jié)果Table 1 Detection results of probe L to Ag+in environmental water

3 結(jié) 論

設(shè)計、合成了一種以N-乙基咔唑為熒光團和雜冠醚為識別基團的Ag+熒光探針L。該探針隨著Ag+的加入，表現(xiàn)出明顯的熒光猝滅現(xiàn)象。通過與其他金屬離子對比，L對Ag+的檢測顯示出較高的選擇性和抗干擾能力。經(jīng)計算表明，探針L與Ag+以1∶1的比例配位，其配位常數(shù)為 2.01×105L·mol?1，檢出限為4.13 μmol·L?1。在水樣檢測實驗中，對Ag+的檢測回收率為94.0%～103.3%，表明可以應(yīng)用于實際水樣中Ag+的檢測。