趙 歡 張 萱 李慶海 （青島大學附屬青島市市立醫(yī)院內分泌科，青島 266071）

肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是最常見的死亡原因，其病死率在同期惡性腫瘤中高居榜首［1］。肺癌最常見的病理類型是非小細胞肺癌，約占所有肺癌病例數的85%［2-3］。雖然放療、化療及分子靶向藥物等對改善患者預后發(fā)揮了一定的積極作用，但目前肺癌的總生存率仍不超過15%［4］。約2/3 的肺癌患者在確診時已屬晚期［5］。因此，早期診斷對降低肺癌病死率至關重要。若患者在Ⅰ、Ⅱ期被診斷，五年生存率將提高至50%，若癌灶較局限時即被檢測到，五年生存率則高達80%［6］。因此，尋找一種可用于肺癌早期診斷的生物標志物對于改善NSCLC預后具有重要的臨床意義。

天然抗體（natural antibody，NAbs）是在完全缺乏外源性抗原刺激下，無菌小鼠及健康人血清中自發(fā)產生的抗體［7-8］。絕大部分天然抗體由B-1細胞經T 細胞非依賴性途徑產生［9-10］。天然抗體能夠識別并清除機體內的有害分子，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。如健康人血清可表達抗氧化型低密度脂蛋白天然抗體，通過與循環(huán)中的低密度脂蛋白結合促進其清除，從而降低心血管事件的發(fā)生風險［11-12］。天然抗體的水平隨年齡增長逐漸下降。天然抗體的減少可造成體內某些有害分子蓄積，這與老年人群中的某些疾病如腫瘤、動脈粥樣硬化等的高發(fā)有關［13］。提示天然抗體在作為腫瘤診斷標志物方面具有很大的潛在價值。目前國外已有學者提出，天然抗體可用作識別免疫相關疾?。ㄈ绨┌Y）的生物標志物。

調節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）可促進腫瘤的免疫逃逸，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉歸中扮演重要角色［14］。CD25也稱為IL-2受體α 鏈，主要表達在活化的T 細胞、B 細胞等表面，亦表達于Treg 細胞。FOXP3 作為轉錄因子叉頭/翅螺旋家族的一個新成員，特異性表達于Treg，且與Treg的分化及免疫抑制功能密切相關［15-16］。本研究旨在運用抗原表位預測工具設計并合成CD25、FOXP3 線性抗原肽及自行建立的ELISA 檢測方法，通過分析NSCLC 患者血漿CD25、FOXP3 天然抗體的表達變化，明確CD25、FOXP3 天然抗體表達的臨床意義及其對NSCLC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象與分組 選取2014 年11 月至2018年8月于青島大學附屬青島市市立醫(yī)院胸外科首次確診、未經治療的非小細胞肺癌（僅包括腺癌和鱗狀細胞癌）患者200 例，所有患者的診斷均由2 名副高級以上病理科醫(yī)師經術后病理確定。選取同期健康志愿者190 例作為正常對照組。排除標準：①患有肺部良、惡性腫瘤或其他來源的腫瘤；②惡性腫瘤家族史；③患有類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者。本研究經青島市立醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑與儀器 96 孔酶標板（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體（英國Abcam公司）；1.0 mol/L磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖片、小牛血清白蛋白（美國Sigma-Aldrich公司）；顯色劑及終止液（美國Life Technologies 公司）；酶標儀（美國Bio Tek公司）等。

1.2 方法

1.2.1 血漿采集 于清晨、空腹狀態(tài)下，采集兩組研究對象外周靜脈血5 ml，2 500 r/min 離心10 min后收集上層血漿，置于-80℃保存待用。

1.2.2 抗原的設計、合成 利用生物信息學數據庫及在線表位預測軟件設計抗原肽，過程簡述如下：首先，逐條肽段評估其pH 值、親水性、柔性、表面可及性、抗原性等特性。之后，評估每條肽段與HLA-Ⅱ51 個等位基因分子的結合力，篩選出與HLA-Ⅱ高結合力的肽段。然后，預測肽段中潛在的B 細胞表位。最終，對滿足上述要求的肽段進行綜合評估，結合抗原設計的一般原則進行適當調整以實現抗原的優(yōu)化?；谏鲜鲞^程，最終設計并委托上海吉爾生化公司合成了3 條抗原肽，分別為CD25a、CD25b、FOXP3。3 條抗原肽序列信息如表1所示。

表1 CD25 與FOXP3抗原肽的序列信息Tab.1 Information of peptide antigens derived from CD25 and FOXP3

1.2.3 抗原的溶解與包被 67%冰乙酸溶解、稀釋抗原至工作濃度5 mg/ml。按照Thermo Fisher Scientific說明書操作步驟包被抗原。

1.2.4 ELISA 法檢測抗 CD25、FOXP3 抗體 實驗操作步驟詳見之前研究［17］，現簡述如下：0.1%PBST洗滌96孔酶標板3次，將血漿樣本以0.5%BSA稀釋100 倍后每孔加樣50 μl，室溫孵育1.5 h。將過氧化物酶標記的IgG 二抗以0.5%BSA 稀釋50 000 倍后每孔加入50 μl，室溫孵育1 h。洗板3次后每孔加入顯色劑 50 μl，避光顯色 25 min 后加入 25 μl 終止液終止反應，在450 nm標準波長和620 nm參考波長下讀取吸光度。每板同時設空白對照、陽性對照、正常對照，每一樣本均設雙復孔。所有樣本均重復測定2 次，以2 次測定值的平均值代表每一樣本的OD值。以特異性結合指數（specific binding index，SBR）代表血漿 CD25、FOXP3 抗體的水平。SBR 的計算公式如下：SBR=（OD樣本-OD陰性對照）（/OD陽性對照-OD陰性對照）。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0軟件建立數據庫并分析數據，采用Graphpad prism 5.0軟件繪制ROC曲線，Kolmogorov-Smirnov檢驗對計量資料進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的數據采用Student'st檢驗進行組間比較，偏態(tài)分布的數據則采用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較。多個獨立樣本之間的兩兩比較采用LSD 檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。應用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析 CD25、FOXP3 抗體對NSCLC 的診斷效能，并計算靈敏度及特異度。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 組及對照組的基線特征比較 NSCLC組 200 例，其中男 125 例，女 75 例，中位年齡為 60 歲（38～79歲）。對照組190例，其中男101例，女89例，中位年齡為59.5歲（38～79歲）。兩組的性別、年齡、吸煙史等臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 NSCLC組及對照組的基線特征［，例（%）］Tab.2 Baseline characteristics of NSCLC patients and control subjects［，n（%）］

表2 NSCLC組及對照組的基線特征［，例（%）］Tab.2 Baseline characteristics of NSCLC patients and control subjects［，n（%）］

Characteristic NSCLC/%Control/%χ2/t P Age/years Gender（n）Male Female Smoking status（n）Former smoker Never smoker Histological type Squamous cell carcinoma Adenocarcinoma TNM stage（n）58.9±8.558.8±9.1-0.170.87 125（62.5）75（37.5）101（53）89（47）3.490.06 103（51.5）97（48.5）98（51.6）92（48.4）00.98 87（43.5）113（56.5）N/A N/AⅠⅡⅢⅣ20（10.0）95（47.5）40（20.0）45（22.5）N/A N/A N/A N/A

2.2 非小細胞肺癌患者血漿CD25、FOXP3 抗體的表達水平與對照組比較 NSCLC Ⅱ～Ⅳ期患者血漿CD25a、FOXP3 抗體的表達較對照組顯著增加（P＜0.001，P＜0.05），Ⅰ期患者血漿CD25a、FOXP3 抗體的表達與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。NSCLC 患者血漿CD25b 抗體的表達較對照組顯著降低，這一變化在早期即Ⅰ～Ⅱ期患者中尤為顯著（P＜0.001），晚期即Ⅳ期患者血漿CD25b 抗體的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

2.3 不同分期NSCLC 患者血漿CD25、FOXP3 抗體的表達水平 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者血漿CD25a、FOXP3 抗體的表達水平組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。Ⅰ、Ⅱ期NSCLC 患者血漿CD25b 抗體的表達較Ⅳ期患者具有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間CD25b抗體的表達水平無顯著差異（均P＞0.05，表3）。

表3 各組血漿CD25、FOXP3抗體的表達水平比較（）Tab.3 Comparison of expression of CD25 and FOXP3 antibody in plasma of each groups（）

表3 各組血漿CD25、FOXP3抗體的表達水平比較（）Tab.3 Comparison of expression of CD25 and FOXP3 antibody in plasma of each groups（）

Note：1）P＜0.05 vs control group，2）P＜0.001 vs control group，3）P＜0.05 vs stage Ⅳ.

Anti-FOXP3 IgG 0.53±0.25 0.60±0.232）0.55±0.28 0.60±0.241）0.60±0.181）0.62±0.231）Groups n Control NSCLCⅠⅡⅢⅣ190 200 20 95 40 45 Anti-CD25a IgG 0.52±0.17 0.66±0.182）0.61±0.22 0.65±0.172）0.70±0.152）0.67±0.192）Anti-CD25b IgG 0.43±0.22 0.37±0.212）0.31±0.161）3）0.36±0.202）3）0.35±0.141）0.44±0.27

2.4 NSCLC 患者血漿 CD25、FOXP3 抗體的表達與臨床病理特征的關系 CD25a 抗體在不同性別、組織學類型、有無淋巴結轉移的NSCLC 患者血漿中的表達有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而在不同年齡、有無吸煙史、不同腫瘤大小、TNM 分期NSCLC 患者中的表達無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。CD25b 抗體在不同性別、年齡、分化程度的NSCLC 患者血漿中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在不同組織學類型、腫瘤大小、TNM 分期、有無淋巴結轉移患者中的表達無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。而FOXP3 抗體的表達僅與腫瘤的分化程度有關（P＜0.05，表4）。

表4 NSCLC患者血漿CD25抗體及FOXP3抗體的表達與臨床病理特征的關系（）Tab.4 Relationship between plasma levels of antibodies against CD25 and FOXP3 and clinicopathological characteristics of patients with NSCLC（）

表4 NSCLC患者血漿CD25抗體及FOXP3抗體的表達與臨床病理特征的關系（）Tab.4 Relationship between plasma levels of antibodies against CD25 and FOXP3 and clinicopathological characteristics of patients with NSCLC（）

Note：a.Squamous cell carcinoma；b.Adenocarcinma.

Characteristic Gender Male Female Age/year≥60＜60 Smoking status Former smoker Never smoker Histological type SCCa ACb Differentiation grade Well/moderate Poor pT 1～2 3～4 Lymph node metastasis Absent Present TNM stageⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn Anti-CD25a IgG t P Anti-CD25b IgG t P Anti-FOXP3 IgG t P 125 75 0.69±0.17 0.61±0.18 3.070.0020.40±0.23 0.32±0.16 2.600.010.62±0.24 0.56±0.21 1.860.07 102 98 0.67±0.17 0.65±0.18-1.130.260.34±0.17 0.40±0.24-2.190.030.62±0.23 0.58±0.23-1.180.24 103 97 0.62±0.16 0.64±0.18 1.350.310.35±0.17 0.40±0.23 0.520.170.63±0.18 0.66±0.12 1.740.12 87 113 0.69±0.17 0.63±0.18-2.450.020.40±0.21 0.35±0.21-1.850.070.62±0.21 0.58±0.25-1.160.25 100 100 0.65±0.18 0.67±0.17 1.120.260.40±0.23 0.34±0.19 2.100.040.56±0.21 0.63±0.25 2.090.03 196 4 0.66±0.18 0.60±0.12 0.710.480.37±0.21 0.33±0.18 0.430.670.60±0.23 0.68±0.21-0.660.51 102 96 0.63±0.17 0.68±0.18-2.140.040.35±0.20 0.40±0.22-1.540.130.60±0.25 0.60±0.21-0.060.95 20 180 0.61±0.22 0.67±0.17-1.250.210.31±0.16 0.39±0.21-1.410.160.55±0.28 0.61±0.23-1.000.32

2.5 CD25、FOXP3 抗體對 NSCLC 診斷效能的分析 繪制CD25、FOXP3 抗體對NSCLC 診斷的ROC曲線，CD25a 曲線下面積為 0.727（95%CI：0.677～0.778），最佳截斷值為0.55，敏感度為77%，特異度為64%；CD25b 曲線下面積為0.601（95%CI：0.545～0.657），最佳截斷值為0.35，敏感度為62%，特異度為 57%；FOXP3 曲 線 下 面 積 為 0.613（95%CI：0.557～0.669），最佳截斷值為0.54，敏感度為58%，特異度為65%（圖1）。

圖1 血漿CD25、FOXP3抗體診斷NSCLC的ROC曲線圖Fig.1 ROC curve of diagnostic value of CD25 and FOXP3 antibodies for NSCLC

3 討論

Tregs 是一類具有免疫抑制功能的T 細胞亞群，在維持免疫耐受、調控免疫應答中起重要作用［18-19］。Tregs與腫瘤關系密切，它可抑制機體抗腫瘤免疫應答，促進腫瘤的免疫逃逸，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉歸中發(fā)揮重要作用。CD25 分子可表達于激活態(tài)的T 細胞表面，亦可表達于Treg，其在兩者的表達有明顯區(qū)別，FOXP3 在 Treg 的表達具有高度特異性［20］。FOXP3 被認為是目前Tregs 高度特異性的分子標志，其表達與Treg 的成熟、分化及其免疫抑制功能密切相關［21］。本研究通過檢測NSCLC 患者血漿CD25、FOXP3 抗體表達變化，以明確其在 NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為診斷標志物的潛能。

本研究發(fā)現NSCLC 患者血漿CD25a 和FOXP3抗體的水平顯著高于健康對照，且隨肺癌的進展逐漸增加，由此可推測Treg 數量可能與NSCLC 分期呈正相關。隨著肺癌的進展，Treg 數量逐漸增多，CD25a 和FOXP3 分子釋放增加，激活機體體液免疫應答，導致CD25a 和FOXP3 抗體增多。本課題組用流式細胞儀檢測各期NSCLC 患者外周血中Tregs 數目，也證實了這一推測。Ⅳ期NSCLC 患者外周血中Tregs 細胞數量高于Ⅲ期患者，Ⅲ期患者外周血中Tregs細胞數量高于Ⅱ期患者，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對 CD25a 抗體診斷 NSCLC 效能的ROC 曲線分析發(fā)現CD25a 曲線下面積為0.727（95%CI：0.677～0.778），最佳截斷值為 0.55，敏感度為77%，特異度為64%，提示CD25a 抗體對NSCLC 具有一定的診斷價值。進一步分析發(fā)現CD25a 抗體的表達與淋巴結轉移密切相關，提示血漿CD25a 抗體的表達可能與NSCLC 預后有關，這一初步結論仍需大規(guī)?；仡櫺匝芯窟M一步驗證。

本研究根據CD25 分子中不同抗原表位設計了2 個線性抗原肽即CD25a 和CD25b，通過檢測其抗體表達水平發(fā)現CD25a 和CD25b 抗體在NSCLC 患者中呈現出完全相反的表達趨勢。相較于健康對照，CD25a 抗體在NSCLC 患者表達增加，而CD25b抗體在NSCLC 患者表達顯著降低，這一變化在Ⅰ～Ⅲ期NSCLC 患者中尤為顯著，且Ⅰ～Ⅱ期NSCLC 患者CD25b 抗體表達降低較Ⅳ期患者有統(tǒng)計學差異。這源于不同抗原表位的免疫原性不同，與相應B 細胞受體結合后激活免疫應答的能力不同［22］。同時也說明CD25b 天然抗體可能參與維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，其含量減少可削弱機體的免疫監(jiān)視功能，促進NSCLC 的發(fā)生。本研究結果與之前報道的CD25b抗體在NSCLC 患者血漿中的表達存在相反趨勢［23-24］。推測可能與以下因素有關：①由于腫瘤的異質性，同種腫瘤抗體的表達水平可能存在差異；②樣本量及來源不同、偏倚采樣、檢測方法的不同也可能是導致結論不一的原因。

此外，血清腫瘤標志物對NSCLC 的發(fā)生也有一定預測價值，目前臨床常用的NSCLC 腫瘤標志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）等。由于單個標志物對NSCLC 的診斷價值有限，下一步將與上述敏感腫瘤標志物聯合，以提高NSCLC 診斷的敏感度及特異度。

綜上所述，CD25a、CD25b、FOXP3抗體在NSCLC中的表達變化提示其可能參與NSCLC 的發(fā)病機制，其中CD25a 抗體可能對診斷肺癌有幫助，CD25b 抗體在早期NSCLC（Ⅰ～Ⅱ期）中表達降低，可能對肺癌發(fā)生有一定預測價值，但對NSCLC 診斷效能有限，后續(xù)研究將擴大樣本量進一步驗證其對NSCLC的診斷價值，并聯合其他NSCLC 敏感性標志物提高早期NSCLC診斷的靈敏度及特異度。