張 曼 戴建業(yè) 俞 淵 唐乾利 陳金梅（湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長沙 410208）

原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石（primary intrahepatic bile duct stones，PIS）始發(fā)于肝內(nèi)膽管系統(tǒng)，是我國常見病和難治?。?］。研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管組織反復(fù)炎癥損傷是導(dǎo)致PIS 膽道淤塞、結(jié)石形成、甚至膽管癌的主要原因之一，因此預(yù)防和緩解膽道系統(tǒng)炎癥反應(yīng)是治療肝內(nèi)膽管結(jié)石形成的主要思路之一［2-3］。Wnt5a-鈣離子（Ca2+）-活化蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可誘導(dǎo)炎癥因子釋放并引起細(xì)胞損傷［4］。目前國內(nèi)外對于該通路的研究多集中于心腦損傷、關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病，但其在肝內(nèi)膽管結(jié)石形成過程中的調(diào)控作用尚未見報道［5］。此外，肝內(nèi)膽管結(jié)石治療一直是膽道外科難題，外科手術(shù)是西醫(yī)主要治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重危害患者身心健康［6］。因此探尋PIS 新的治療手段尤為重要。課題組經(jīng)驗方大黃靈仙方具有疏肝利膽、攻下排石功效，可有效防止肝內(nèi)膽管結(jié)石形成，得到廣大醫(yī)生和患者認(rèn)可，且前期研究發(fā)現(xiàn)其能抑制膽管細(xì)胞炎癥損傷，但分子機制尚不明確［7］。本研究推測大黃靈仙方可能通過Wnt5a-Ca2+-PKC通路抑制膽管系統(tǒng)炎癥損傷，進而防治肝內(nèi)膽管結(jié)石，并建立PIS 動物模型對此進行驗證，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8 周齡清潔級健康SD 大鼠70只，體質(zhì)量200～250 g，由廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所實驗動物中心提供，合格證號：SCXX（桂）2019-0001，動物質(zhì)量合格證號：省科2000A027。所有大鼠于湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院層流動物房常規(guī)飼養(yǎng)，本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院動物倫理委員會批準(zhǔn)，批號：IACUC-01（20160917），試驗符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 大黃靈仙方由生大黃15 g、威靈仙30 g、芒硝10 g、金錢草30 g、枳殼12 g、雞內(nèi)金10 g、澤蘭15 g、柴胡12 g、郁金12 g、磁石12 g、黃芪30 g、甘草5 g 組成，各中藥配方顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。HE染色試劑盒（貨號：E677218-0200，上海生物公司）；血清總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）ELISA試劑盒（貨號：F6696-A、F6697-A，上海奧陸生物科技有限公司）；大鼠IL-6、腫瘤壞死因子（TNF-α）等ELISA試劑盒（貨號：CSB-E04640r、CSB-E69066r，武漢華美生物工程有限公司）；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：15596026、4366597，賽默飛世爾中國公司）；Fluo-3/AM 鈣熒光指示劑（貨號：JB0234，江蘇碧云天生物有限公司）；Wnt5a、骨橋蛋白（OPN）、PKC、IL-6 抗體（貨號：ab229200、ab75285、ab32376、ab229381，美國Abcam 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號：P0768、P0231，美國Pierce公司）；光學(xué)顯微鏡（SMZ745，日本尼康公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM510，德國Carl Zeiss 公司）；冰凍切片機（CM3050S，德國Leica公司）；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（1659001、Trans-Blot SD，美國 Bio-Rad 公司）；化學(xué)發(fā)光儀（GIS-500，杭州米歐儀器公司）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膽管炎癥損傷模型建立及分組給藥SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大黃靈仙方（320 mg/kg）組、炎癥信號阻斷劑組（PDTC+SB203580，120 mg/kg+10 mg/kg）、大黃靈仙方+信號阻斷劑組（320 mg/kg+120 mg/kg+10 mg/kg），每組12只，除正常對照組外，其余各組大鼠均參照文獻［8］采用戊巴比妥鈉麻醉，暴露膽總管，均經(jīng)膽總管內(nèi)緩慢注入1 ml LPS 溶液（2 μg/ml），分層關(guān)腹，建立PIS模型。正常對照組經(jīng)膽總管內(nèi)緩慢注入1 ml 生理鹽水，其余均同模型組。建模前3 d 開始灌胃給藥，正常對照組及模型組給予生理鹽水，大黃靈仙方組及炎癥信號阻斷劑組按文獻［7］設(shè)置劑量并進行灌胃及腹腔注射干預(yù)3 d。

1.2.2 大鼠標(biāo)本采集 末次給藥12 h，取各組麻醉后大鼠腹主動脈血2 ml，分離血清置于-20℃保存。各組隨機取6 只大鼠，迅速處死，開腹，并經(jīng)下腔靜脈注射肝素進行全身肝素化灌注預(yù)熱，待肝臟變?yōu)榫坏耐咙S色時，在外科顯微鏡下取完整膽管樹，稱重，置于液氮中冷凍30 min，-80℃保存。另外6只大鼠同樣取膽管樹組織標(biāo)本，部分置于-80℃保存，其余部分清洗后置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2.3 各組大鼠血清炎癥因子及肝功能指標(biāo)檢測 取1.2.2 中血清，4℃冰箱解凍，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6 及肝功能指標(biāo)TBIL、TBA水平。

1.2.4 各組大鼠膽管組織HE染色病理形態(tài)觀察取1.2.2 中4%多聚甲醛中膽管組織，常規(guī)透明，浸蠟，包埋，切片（5 μm），按HE 試劑盒說明書染色，光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.2.5 RT-qPCR 檢測膽管組織 Wnt5a、OPN 及 PKC mRNA 表達 取各組1.2.2 中-80℃ 保存的膽管組織，4℃ 解凍，勻漿，Trizol 試劑盒抽提總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板進行RT-qPCR 反應(yīng)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設(shè)計見表1。以β-actin 為 內(nèi) 參 ，2-ΔΔCt法 計 算 Wnt5a、OPN 及 PKC mRNA相對表達。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.6 Western blot 法檢測膽管組織中Wnt5a、OPN、PKC、IL-6 蛋白表達 取 1.2.2 中-80℃ 保存膽管組織，4℃解凍，蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白總濃度。取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 溶液清洗3 次，加入一抗（Wnt5a、OPN、PKC、IL-6、β-actin），內(nèi)參抗體1∶2 000稀釋，其余抗體1∶1 000 稀釋，4℃搖床室溫孵育過夜，TBST 振洗，加入 HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000 稀釋），37℃ 搖床室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，增強化學(xué)發(fā)光法顯色，化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照，Image J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.2.7 熒光免疫法檢測膽管組織細(xì)胞Ca2+濃度取1.2.2中膽管樹組織標(biāo)本，冷凍切片機切片（8 μm），按Fluo-3/AM 鈣熒光指示劑說明書進行熒光標(biāo)記，調(diào)整激光共聚焦顯微鏡激發(fā)波長為488～500 nm，物鏡下觀察膽管組織Ca2+熒光強度，熒光強弱反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平，Image-RroPlus6.0 圖像處理系統(tǒng)測定標(biāo)本淺層區(qū)域面積及熒光強度，以單位面積熒光強度表示膽管組織細(xì)胞Ca2+水平［9］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃靈仙方對血清TBIL、TBA 水平的影響與正常對照組相比，模型組大鼠血清TBIL、TBA 水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠血清TBIL、TBA 水平均降低（P＜0.05）；與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠血清TBIL、TBA水平進一步降低（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠血清TBIL、TBA水平比較（，n=12，μmol/L）Tab.2 Comparison of serum TBIL and TBA levels of rats（，n=12，μmol/L）

表2 大鼠血清TBIL、TBA水平比較（，n=12，μmol/L）Tab.2 Comparison of serum TBIL and TBA levels of rats（，n=12，μmol/L）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent TBIL 2.36±1.39 142.98±19.211）89.14±13.621）2）53.27±9.861）2）3）TBA 8.60±3.56 129.28±17.361）82.54±11.071）2）59.62±10.351）2）3）35.82±6.121）2）3）4）37.29±7.131）2）3）4）

2.2 大黃靈仙方對血清炎癥因子的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠血清TNF-α、IL-6水平進一步降低（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（，n=12）Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats（，n=12）

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（，n=12）Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats（，n=12）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent TNF-α/（ng·L-1）11.16±1.69 39.15±3.401）33.09±3.311）2）25.04±2.521）2）3）IL-6/（pg·ml-1）103.09±10.09 185.32±18.101）166.08±16.121）2）144.84±14.151）2）3）19.12±1.641）2）3）4）124.38±14.141）2）3）4）

2.3 大黃靈仙方對膽管組織形態(tài)的影響 正常對照組大膽管組織形態(tài)正常。模型組大鼠可見膽管細(xì)胞變性、增生，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤及膽小管擴張淤積明顯。炎癥信號阻斷劑組、大黃靈仙方組、大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠膽管組織變性、炎癥浸潤等病理損傷現(xiàn)象逐漸緩解（圖1）。

圖1 各組大鼠膽管組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of bile duct tissue of rats in each group（×200）

2.4 大黃靈仙方對膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達進一步降低（P＜0.05，表4）。

表4 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達比較（，n=6）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of Wnt5a，OPN and PKC in bile duct tissue of rats（，n=6）

表4 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表達比較（，n=6）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of Wnt5a，OPN and PKC in bile duct tissue of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent Wnt5a/β-actin 0.16±0.09 1.33±0.151）OPN/β-actin 0.19±0.06 1.36±0.161）PKC/β-actin 0.18±0.08 1.39±0.141）1.01±0.121）2）1.03±0.131）2）1.07±0.121）2）0.74±0.131）2）3）0.71±0.121）2）3）0.73±0.141）2）3）0.42±0.121）2）3）4）0.48±0.131）2）3）4）0.42±0.131）2）3）4）

2.5 大黃靈仙方對膽管組織Wnt5a、OPN、PKC 及IL-6 蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠膽管組織 Wnt5a、OPN、PKC 及 IL-6 表達水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC 及IL-6 表達水平均降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，大黃靈仙方+信號阻斷劑組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表達水平進一步降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表達比較（，n=6）Tab.5 Comparison of expressions of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 in bile duct tissue of rats（，n=6）

表5 大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表達比較（，n=6）Tab.5 Comparison of expressions of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 in bile duct tissue of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

IL-6/β-actin 0.38±0.10 1.59±0.131）1.22±0.141）2）0.89±0.111）2）3）0.42±0.101）2）3）4）Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent Wnt5a/β-actin 0.26±0.09 1.43±0.151）1.11±0.121）2）0.84±0.131）2）3）0.49±0.121）2）3）4）OPN/β-actin 0.29±0.06 1.46±0.161）1.13±0.131）2）0.81±0.121）2）3）0.51±0.131）2）3）4）PKC/β-actin 0.28±0.08 1.49±0.141）1.17±0.121）2）0.83±0.141）2）3）0.52±0.131）2）3）4）

圖2 Western blot 檢測各組大鼠膽管組織Wnt5a、OPN、PKC及IL-6蛋白表達Fig.2 Western blot of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 protein expressions in bile duct tissue of rats in each group

2.6 大黃靈仙方對膽管組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠膽管組織細(xì)胞熒光強度較高，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組大鼠膽管組織細(xì)胞熒光強度較低，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平均降低（P＜0.05）。與炎癥信號阻斷劑組及大黃靈仙方組相比，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平進一步降低（P＜0.05，圖3、表6）。

表6 大鼠膽管組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平比較（，n=6）Tab.6 Comparison of intracellular Ca2+ levels in bile duct tissues of rats（，n=6）

表6 大鼠膽管組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平比較（，n=6）Tab.6 Comparison of intracellular Ca2+ levels in bile duct tissues of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Ca2+level/AU 0.50±0.05 1.86±0.131）0.76±0.071）2）0.67±0.051）2）3）0.58±0.041）2）3）4）Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent

圖3 各組大鼠膽管組織細(xì)胞Ca2+水平熒光圖（×400）Fig.3 Fluorescence diagram of Ca2+level in bile duct tissue cells of rats in each group（×400）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為膽石癥與膽管炎癥關(guān)系密切，膽管炎癥反應(yīng)會引起膽管炎性狹窄、梗阻及膽汁引流不暢，是膽石癥形成的關(guān)鍵病理機制［10］。LPS 可誘導(dǎo)或加重機體炎癥反應(yīng)，引起結(jié)石或?qū)е陆Y(jié)石復(fù)發(fā)率上升［11］。本研究經(jīng)膽管內(nèi)注射LPS 后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清TNF-α、IL-6 及膽管組織IL-6 蛋白表達均顯著高于正常對照組，同時肝組織出現(xiàn)膽管細(xì)胞變性、增生、匯管區(qū)炎癥浸潤、膽管擴張淤積等病理損傷，與人類膽管結(jié)石組織病理學(xué)相似，提示造模成功［12］。另外，文獻證實PIS 患者結(jié)石化學(xué)成分中絕大部分為膽紅素鈣結(jié)石，且臨床發(fā)現(xiàn)膽石癥患者血清肝功能指標(biāo) TBIL、TBA 水平均不同程度升高［13］。本研究也檢測到模型組大鼠血清TBIL、TBA 水平異常升高，進一步表明造模成功。

中醫(yī)將膽石癥歸為“脅痛”“黃疸”范疇，認(rèn)為“外感六淫、情志不暢、飲食失節(jié)、脾胃虛弱、肝陰不足”等所致肝膽氣機不暢，疏泄失常，濕熱蘊蒸于肝膽，膽汁通降不暢，日久成石，堵塞于膽道是膽石癥形成的主要病機，主要以疏利肝膽、清熱利濕藥疏通臟腑淤積，且療效較好［14］。本科室經(jīng)驗方大黃靈仙方中金錢草、柴胡、雞內(nèi)金、郁金及澤蘭等藥物均可入肝膽，具有清熱、利濕、解郁之功，白芍、黃芪等養(yǎng)陰柔肝、補氣升陽能調(diào)暢肝膽氣機而解淤滯，全方契合膽石癥的病因病機，重在清熱利濕、疏肝利膽排石。另外，研究報道金錢草、雞內(nèi)金、郁金在泌尿系統(tǒng)結(jié)石中有較好的排石功效［15］。本研究發(fā)現(xiàn)大黃靈仙方組大鼠血清TNF-α、IL-6及膽管組織IL-6蛋白表達降低，且肝膽管組織病理損傷明顯減輕，表明大黃靈仙方能夠降低炎癥反應(yīng)、緩解肝內(nèi)膽管組織炎癥損傷。

藥物治療膽石癥常從削弱炎癥信號通路出發(fā)，通過減輕炎癥反應(yīng)減少結(jié)石形成［16］。Wnt5a/Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)控炎癥反應(yīng)降低組織損傷［17］。研究證實炎癥刺激下，細(xì)胞中的Wnt5a可與卷曲蛋白-2受體特異性結(jié)合，激活G蛋白和散亂蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，在活化PKC 及鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ表達的同時，誘發(fā)IL-6、TNF-α 等炎癥因子大量表達，加重組織損傷［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠膽管組織中Wnt5a、PKC mRNA 及蛋白表達、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平異常高于正常對照組，提示W(wǎng)nt5a-Ca2+-PKC 信號通路活化可能參與膽管組織炎癥反應(yīng)。另外，促炎細(xì)胞因子也可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌OPN，通過與細(xì)胞表面OPN 受體結(jié)合放大炎癥反應(yīng)，加速細(xì)胞凋亡［20］。Wnt5a 與 OPN 間也存在調(diào)控關(guān)系，在膝關(guān)節(jié)炎中被證明共同參與炎癥反應(yīng)進程［21］。本研究在模型組大鼠膽管組織中檢測到OPN mRNA 及蛋白表達異常增高，而采用炎癥信號阻斷劑阻斷炎癥反應(yīng)后，隨著大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6 及膽管組織 IL-6 蛋白表達降低，大鼠膽管組織中Wnt5a、PKC mRNA、OPN mRNA 及蛋白表達、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平降低的同時，肝膽管組織病理損傷明顯緩解，進一步證實Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路參與膽管組織炎癥反應(yīng)。給予大黃靈仙方治療后，大鼠膽管組織中Wnt5a、PKC、OPN mRNA 及蛋白表達、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平均降低，提示大黃靈仙方可抑制Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路活化，可能是其降低膽管組織炎癥反應(yīng)、防治膽管結(jié)石的機制之一。而大黃靈仙方與炎癥通路阻斷劑聯(lián)用后，大鼠上述通路指標(biāo)進一步降低的同時，膽管組織炎癥損傷也進一步緩解，表明炎癥信號阻斷劑可進一步促進大黃靈仙方抑制Wnt5a-Ca2+-PKC信號通路活化作用。

綜上所述，大黃靈仙方可能通過抑制Wnt5a-Ca2+-PKC 信號通路活化降低膽管組織炎癥反應(yīng)，為闡明大黃靈仙方防治膽管結(jié)石的分子機制提供參考。但中藥防治膽管結(jié)石的靶點及途徑較多，有待進一步研究。