孫海濤 高 濤 馮小東 （首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038）

人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblasts，HPLDFs）位于牙周膜組織膠原纖維中的間質(zhì)細(xì)胞，在牙周組織的發(fā)育、損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［1］。正常生理狀態(tài)下，HPLDFs 可促進(jìn)合成和降解膠原，分泌多種細(xì)胞活性因子、刺激成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞以完成牙周組織的修復(fù)與再生，并促進(jìn)牙槽骨及牙本質(zhì)膠原不斷更新和重塑以維持牙槽骨的穩(wěn)態(tài)［2-3］。受外界刺激時(shí)，HPLDFs 的生物學(xué)活性異?；罨?，激活并促進(jìn)牙周組織損傷，最終引起牙周結(jié)締組織纖維化及牙槽骨病變［4］。目前，體外分離培養(yǎng)HPLDFs是研究牙周膜組織疾病的重要手段之一。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的非編碼RNA［5］。最新測(cè)序研究表明，lncRNAs 參與細(xì)胞的發(fā)育分化、增殖、遷移及凋亡等生物功能［6］。多項(xiàng)研究表明，某些lncRNAs 通過(guò)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄前后等方式調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和活化，從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展［7-8］。MITCHELL等［9］證實(shí)lncRNA MALAT1可參與內(nèi)調(diào)控皮細(xì)胞功能和血管生長(zhǎng)。lncRNA MALAT1 下調(diào)可抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減弱左室功能，抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而減弱視網(wǎng)膜血管損傷的炎癥反應(yīng)［10］。TAO等［11］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA H19可抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖，可能與導(dǎo)致DUSP5/ERK1/2 軸相關(guān)的部分基因異常表達(dá)以及引起細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。已有研究證明，過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1與食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤分型和分期密切相關(guān)［12］。上調(diào)lncRNA TUG1 表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞的增殖［13-14］。因此，lncRNA TUG1 在發(fā)育和功能維持方面有重要作用，其表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種疾病。但lncRNA TUG1在HPLDFs 中參與調(diào)控牙周組織功能的作用及機(jī)制未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究高表達(dá)lncRNA TUG1 對(duì)HPLDFs 增殖、遷移及膠原合蛋白成的影響，進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)TGF-β1/Smads 信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響以探討相關(guān)的分子機(jī)制，為lncRNA 調(diào)控牙周組織病變、修復(fù)及再生過(guò)程提供新思路，為進(jìn)一步治療牙周病提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 健康志愿者（12～20 歲）前磨牙或智齒，取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院、北京積水潭醫(yī)院及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院口腔科正畸拔除的牙齒，均無(wú)齲壞、牙周炎及根尖周疾病等，患者及其家屬均知情同意。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Life 公司；波形絲蛋白及角蛋白抗體購(gòu)自Abcam 公司；t-Smad3、p-Smad3 及 TGF-β1 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology 公 司 ；GAPDH 抗 體 購(gòu) 自Proteintech 公司；青霉素、鏈霉素和Ⅰ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；DAPI 染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；所有PCR 引物均由生工生物公司提供；lncRNA TUG1 過(guò)表達(dá)慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.3 主要儀器 ABI 7500 實(shí)時(shí)定量PCR 儀購(gòu)自Applied Biosystems 公司；微量移液器購(gòu)自Eppendorf公司；生物安全柜購(gòu)自Heal Force 公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自 Thermo Scientific 公司；SynergyTM2 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 HPDLCs 的分離培養(yǎng)及鑒定 HPDLCs 采用組織貼壁消化法分離而得。拔取新鮮牙齒標(biāo)本后迅速置于含雙抗預(yù)冷的PBS 中，清洗去除血污。將牙齒標(biāo)本立即轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)，于無(wú)菌條件下刮除牙根上1/3 牙周膜組織。將牙周膜組織置于無(wú)菌離心管，1 200 r/min 離心5 min。棄上清液，加入0.5%Ⅰ型膠原酶500 μl，置于37℃恒溫?fù)u床，20～30 min 后加入 500 μl DMEM 完全培養(yǎng)基中和，1 200 r/min 離心5 min。棄上清液，挑取細(xì)胞沉淀分別鋪于培養(yǎng)皿中，加入少量培養(yǎng)基，微微傾斜置于37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中。30 min 后緩慢放平培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)1 周。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后使用0.25%胰酶37℃消化3 min，加入完全培養(yǎng)基中和，按1∶3 比例傳代。收集第3代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)60%后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HPDLCs 的鑒定 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定HPDLCs標(biāo)志物。使用0.25%胰酶消化并收集第 3 代細(xì)胞，以 1×105個(gè)/ml 接種于培養(yǎng)小室，孵育培養(yǎng)過(guò)夜。4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗3次，每次5 min。加入含 0.5%Triton 的 5%BSA 進(jìn)行細(xì)胞穿孔及抗原封閉，室溫靜置40 min。加入100 μl一抗（波形蛋白 Vimentin，1∶200；角蛋白 Keratin，1∶200），4℃ 孵育過(guò)夜，同時(shí)以PBS 代替抗體作為陰性對(duì)照。PBS 清洗 3 次，每次 5 min。加入 100 μl 二抗，室溫孵育45 min，PBS 清洗，梯度乙醇脫水封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 重組lncRNA TUG1 慢病毒感染構(gòu)建過(guò)表達(dá)HPDLCs［15］取第 3 代生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的 HPDLCs 接種于6 孔板，細(xì)胞分為過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1 慢病毒組（Lv-lncRNA TUG1）、慢病毒空載體組（Lv-NC）和空白對(duì)照組（Ctrl）。過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1 慢病毒組、慢病毒空載體組分別加入Lv-lncRNA TUG1、Lv-NC對(duì)照空白質(zhì)粒病毒和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染HPDLCs，空白組不做處理，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后，吸棄含病毒培養(yǎng)基，更換2 ml 10%FBS 完全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；病毒感染72 h后，消化細(xì)胞行后續(xù)處理。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 收獲各組細(xì)胞 HPDLFs，置于 1.5 ml 無(wú)酶 EP 管，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，每管加入1 ml Trizol，置于冰上充分裂解后，加200 μl氯仿，室溫靜置5 min；4℃、12 000 r/min 離心 5 min。取 500 μl 上清液，加入等量異丙醇混勻，-20℃ 靜置30 min；4℃、12 000 r/min離心30 min后，可見白色沉淀，棄上清液；加入200 μl 75%乙醇，4℃、12 000 r/min離心5 min；棄上清，室溫干燥5～10 min；加入20 μl DEPC 充分溶解。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA 純度，控制A260/A280在1.9～2.1，RNA 電泳檢測(cè)其完整性。檢測(cè)濃度及純度后取2 μg 總RNA 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s。將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 純化后應(yīng)用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μl∶1.5 μl cDNA 模板，1 μl 引物，10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，7.5 μl H2O。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性30 s，擴(kuò)增循環(huán)95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 為參照，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 lncRNA TUG1 mRNA 的相對(duì)定量表達(dá)量；以 TGF-β1 為參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算COLⅠ、COLⅢ和COLⅣ mRNA的相對(duì)定量表達(dá)量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 相關(guān)引物序列Tab.1 Relevant primer sequences

1.2.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 過(guò)表達(dá)lncRNA 組、空白質(zhì)粒病毒處理組和空白對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h收獲各組細(xì)胞HPDLFs，分別接種于96孔板，接種密度 3 000 個(gè)/孔，37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。在 0 h 和 24 h 將10 μl/孔 CCK-8 試劑加入各孔細(xì)胞，37℃ 培養(yǎng) 1 h 后測(cè)定450 nm處吸光度值。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 過(guò)表達(dá)lncRNA組、空白質(zhì)粒病毒處理組和空白對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h收獲各組細(xì)胞HPDLFs，分別接種于6 孔板，細(xì)胞單層融合80%～90%時(shí)，換成2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。用200 μl 槍頭在各組細(xì)胞中垂直劃線，無(wú)菌PBS 清洗 1 遍，換成 2%FBS 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。同時(shí)，對(duì)細(xì)胞劃痕進(jìn)行成像和測(cè)量，用虛線區(qū)域測(cè)量細(xì)胞遷移面積。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 收獲各組細(xì)胞HPDLFs，用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。將提取的蛋白樣本與含SDS的loading 緩沖液混合，通過(guò)10%SDS-PAGE 膠進(jìn)行蛋白分離，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA溶液室溫封閉1 h。按照抗體說(shuō)明書稀釋一抗（GAPDH，1∶1 000；t-Smad3、p-Smad3、TGF-β1，1∶1 000），4℃ 孵育過(guò)夜。用TBST 清洗3 次，加入二抗，室溫下孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)并拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差One Way ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPDLFs 鑒定 HPDLFs 培養(yǎng) 1 周后可見大量集落生長(zhǎng)的細(xì)胞，呈紡錘形，有多個(gè)突起（圖1A）。傳代培養(yǎng)至P3 代，細(xì)胞形態(tài)均勻飽滿，提示可能分離培養(yǎng)得到HPDLCs。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)細(xì)胞免疫表型進(jìn)行鑒定（圖1B、C），與陰性對(duì)照組相比，波形蛋白Vimentin 呈陽(yáng)性，角蛋白Keratin 呈陰性；陰性對(duì)照組均未見陽(yáng)性染色結(jié)果（圖1D、E）。表明提取的原代HPDLCs 純度較高，無(wú)雜細(xì)胞，可用于后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。

圖1 代表性HPDLFs特性Fig.1 Characteristics of representative HPDLFs

2.2 重組慢病毒感染HPDLFs 中l(wèi)ncRNA TUG1 的表達(dá)水平 過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1 慢病毒組（LvlncRNA TUG1）HPDLFs 細(xì)胞 lncRNA TUG1 表達(dá)水平較空白對(duì)照組（Ctrl）或空白質(zhì)粒病毒處理組（Lv-NC）顯著增加（P＜0.01），而Ctrl 組或Lv-NC 組HPDLFs 細(xì)胞lncRNA TUG1 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 3組HPDLFs細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá)比較Fig.2 Comparison of lncRNA TUG1 expression in HPDLFs of 3 groups

2.3 過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1 對(duì)HPDLFs 增殖的影響 Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細(xì)胞吸光度值在培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時(shí)均較Ctrl組或Lv-NC組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而 Ctrl 組或 Lv-NC 組HPDLFs細(xì)胞吸光度值在培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)3組HPDLFs細(xì)胞增殖能力的比較Fig.3 Comparison of HPDLFs cell proliferation for different incubation time in 3 groups

2.4 過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1 對(duì)HPDLFs 遷移的影響 Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細(xì)胞劃痕面積均較 Ctrl 組或 Lv-NC 組顯著減少（P＜0.01），而 Ctrl 組或Lv-NC 組HPDLFs 細(xì)胞劃痕面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 3 組HPDLFs 細(xì)胞遷移情況（A）和細(xì)胞劃痕面積（B）比較Fig.4 Comparison of HPDLFs cell migration condition（A）and cell healing area（B）in 3 groups

2.5 lncRNA TUG1 對(duì) HPDLFs 纖維鈣化的影響Lv-lncRNA TUG1 組 HPDLFs 細(xì)胞中 COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ及MMP-2 mRNA表達(dá)水平均較Ctrl組或Lv-NC組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而Ctrl 組或Lv-NC組 HPDLFs 細(xì)胞中 COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ及 MMP-2 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 3組HPDLFs細(xì)胞中COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ及MMP-2相對(duì)表達(dá)量比較Fig.5 Comparison of relative expressions of COLⅠ，COLⅢ，COLⅣand MMP-2 in HPDLFs of 3 groups

2.6 lncRNA TUG1 在HPDLFs 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的分子機(jī)制研究 Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細(xì)胞中 TGF-β1 蛋白表達(dá)水平均較 Ctrl 組或 Lv-NC 組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而 Ctrl 組或 Lv-NC 組HPDLFs 細(xì)胞中TGF-β1 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖 6A。Lv-lncRNA TUG1 組HPDLFs 細(xì)胞中p-Smad3 蛋白表達(dá)水平均較Ctrl 組或 Lv-NC 組顯著增加，而 Ctrl 組或 Lv-NC 組 HPDLFs細(xì)胞中p-Smad3 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 組HPDLFs 細(xì)胞中t-Smad3 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6B。

圖6 3 組 HPDLCs 中 TGF-β1 和 Smad3 蛋白的表達(dá)情況比較Fig.6 Comparison of expressions of TGF-β1 and Smad3 proteins in HPDLFs of 3 groups

3 討論

牙周炎在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為十萬(wàn)分之一，其高復(fù)發(fā)率、長(zhǎng)期療效不佳易導(dǎo)致牙齒周圍槽骨逐漸喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［16-17］。遺傳因素是牙周組織發(fā)育及炎癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此，尋找新的標(biāo)志物以開發(fā)更有效、安全的治療策略具有重要臨床意義［18］。HPLDFs 與牙周組織病變、修復(fù)及再生過(guò)程密切相關(guān)，能持續(xù)合成與降解膠原蛋白纖維以維持牙周組織的更新與重建，且HPLDFs 還能分泌多種細(xì)胞活性因子刺激成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞完成牙周組織的修復(fù)與再生，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族BMP-2、BMP-4及BMP-7等［19］。因此，HPLDFs 異常活化也是牙周炎發(fā)病的主要決定因素之一。

研究表明，lncRNA 失調(diào)可導(dǎo)致多種包括炎癥性疾病、纖維化和腫瘤等相關(guān)疾?。?0-21］。近年來(lái)，lncRNA 參與多種纖維化疾病發(fā)生的研究日益受到關(guān) 注［22］。lncRNA TUG1 是 一個(gè) 長(zhǎng) 度為 7.1 kb 的lncRNA，首次在小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育的基因組篩檢中被發(fā)現(xiàn)［23］。近期研究表明，lncRNA TUG1 是一種新型癌基因，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移如lncRNA TUG1 表達(dá)下調(diào)可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，并激活細(xì)胞凋亡過(guò)程［14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中l(wèi)ncRNA TUG1 表達(dá)下調(diào)［24］。研究證實(shí)，lncRNA 對(duì) HPDLFs 的影響主要為促進(jìn)細(xì)胞增殖、膠原合成、成骨分化等［25］。然而，lncRNA TUG1 在HPDLFs 中的潛在功能尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)lncRNA TUG1的HPDLFs增殖、遷移均顯著增加，提示lncRNA TUG1 是治療牙周病的新靶點(diǎn)，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HPDLFs的活化。

TGF-β1 參與牙齒移動(dòng)、牙周組織發(fā)育、損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過(guò)程，可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的HPDLFs 增殖和 ALP 活性［25-27］。體外研究表明，TGF-β1在早期可誘導(dǎo)Ⅰ型膠原mRNA 表達(dá)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，膠原的表達(dá)反而受到抑制［28］。但是，對(duì)于lncRNA在HPDLFs 纖維鈣化方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究初步探討了lncRNA TUG1對(duì)HPDLFs 增殖、膠原合成、纖維鈣化等作用可能涉及的信號(hào)通路。與對(duì)照組相比，lncRNA TUG1 可上調(diào) TGF-β1 和 p-Smad3 信號(hào)蛋白的表達(dá)量，提示lncRNA TUG1 可能通過(guò)激活 TGF-β1/Smads 途徑促HPDLFs的異?；罨?。本研究還表明，lncRNA TUG1是治療牙周病的新靶點(diǎn)，提示其可通過(guò)上調(diào)TGF-β1/Smads信號(hào)通路促進(jìn)HPDLFs的增殖、遷移能力及纖維化。

綜上所述，lncRNA TUG1 是治療牙周病的新靶點(diǎn)，lncRNA TUG1 表達(dá)上調(diào)可顯著促進(jìn)HPLDFs 的增殖、遷移及促進(jìn)COLⅠ、COLⅢ、COLⅣ和MMP-2的 mRNA 水平，同時(shí)上調(diào) TGF-β1/p-Smad3 信號(hào)通路蛋白，提示 lncRNA TUG1 通過(guò)激活 TGF-β 途徑促HPLDFs 增殖、遷移及纖維化過(guò)程，但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索。