李首慶 米旭光 劉 磊 馬寅芙 魏海峰 方艷秋 （吉林省人民醫(yī)院中心實驗室，長春 130021）

肝癌是高發(fā)、高轉(zhuǎn)移且致死性高的惡性腫瘤，尋找miRNA 與肝癌轉(zhuǎn)移之間的機制是攻克肝癌發(fā)展轉(zhuǎn)歸的研究方向之一。miR-100 參與抑制多種腫瘤的增殖和耐藥性［1-4］。溴結(jié)構(gòu)區(qū)鄰近至鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白 2A 即 BAZ2A 基因（bromodomain adjacent to zinc finger domain 2A），可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。本研究的前期工作中發(fā)現(xiàn)BAZ2A 基因在肝癌細胞中高表達，且BAZ2A 受到miRNAs 的直接或間接調(diào)控，這些機制可能是研究腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移和治療的新契點。BAZ2A 為miR-100 的靶基因之一，本研究旨在探討在肝癌轉(zhuǎn)移過程中miR-100對于BAZ2A的作用及機制，從而進一步對肝癌的診療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞SMMC-7721、BEL-7402、人正常肝細胞HL-7702 和人腎HEK293T 細胞為本實驗室凍存。胎牛血清、RPMI medium 1640（GIBCO，美國）；RT-PCR 試劑盒（Promega，美國）；SYBR Green Master（Roche，瑞士）；Trizol、LipofectamineTM2000（Life Technologies，美國）、Matrigel（Sigma，美國）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（Axygen，美國）；Has-miR-100 mimics及陰性對照（上海百奧邁科，中國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)使用含10%FBS 和雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2和100%飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱。細胞密度達到約90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA提取和qRT-PCR檢測 選取細胞狀態(tài)好的人肝癌細胞SMMC-7721、BEL-7402和人正常肝細胞HL-7702 進行RNA 提?。═rizol 法），以核酸分析儀測定提取的RNA 濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄說明書將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再進行PCR 反應(yīng)并電泳分析。

1.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及細胞總RNA 提取 肝癌細胞SMMC-7721 密度達到約90%時，將細胞轉(zhuǎn)至6 孔板（2×105個/孔），miR-100 mimics 5 μl（終 濃 度 為50 nmol/L）以 LipofectamineTM2000 5 μl 轉(zhuǎn)染肝癌細胞SMMC-7721，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞，進行細胞RNA 提取和蛋白提取用于后續(xù)實驗。（注：構(gòu)建的BAZ2A 高表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BAZ2A轉(zhuǎn)染方法）。

1.2.4 qRT-PCR 檢測 qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染細胞中miR-100 和 BAZ2A 基因的表達量。miR-100 表達以U6 作為內(nèi)參，BAZ2A 表達以 GAPDH 為內(nèi)參。結(jié)果以2-ΔΔCt表示mRNA拷貝數(shù)比值。

1.2.5 Western blot 1.2.3 中的轉(zhuǎn)染細胞及對照細胞用細胞裂解液重懸，離心取上清后，進行蛋白濃度分析。蛋白上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉，酶標(biāo)儀檢測，拍照。

1.2.6 熒光素酶活性檢測 以DNA 寡核苷酸退火緩沖液（Annealing Buffer 5×）用于BAZ2A 3'UTR 引物序列及突變引物序列BAZ2A 3'UTR-mut 的退火。PCR 反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物直接與pmirGLO 熒光質(zhì)粒4℃連接過夜。轉(zhuǎn)化后提取連接質(zhì)粒（pmir-BAZ2A 3'UTR、pmir-BAZ2A 3'UTR-mut）用于熒光素酶活性檢測。將miR-100 mimics（終濃度50 nmol/L）與構(gòu)建的pmirGlo 系列質(zhì)粒（終濃度300 ng/孔）、內(nèi)參β-半乳糖苷酶（β-gal，30 ng/孔）共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞（12 孔板），同時設(shè)NC 及 pmirGlo 空質(zhì)粒對照組，且每組3 個復(fù)孔，制備細胞裂解液；取96 孔熒光素檢測白板，每孔加入5 μl 熒光素酶分析緩沖液（Assay cocktail），將 45 μl 細胞裂解液加入對應(yīng)檢測孔中，混勻（避免氣泡產(chǎn)生）；放入熒光免疫分析儀后，每孔加入100 μl熒光素反應(yīng)液，直接啟動程序檢測活性。

1.2.7 miR-100對肝癌細胞增殖遷移能力的影響SMMC-7721 細胞懸液接種6 孔板，次日細胞密度達60%～70%進行細胞轉(zhuǎn)染，設(shè)陰性對照組，分別于劃痕0 h、24 h、48 h 進行細胞遷移拍照，以軟件統(tǒng)計劃痕處細胞遷移的寬度，量化圖統(tǒng)計分析細胞遷移差異。

1.2.8 Transwell 小室侵襲及遷移實驗 4℃過夜融化Matrigel，并用預(yù)冷的不含血清的DMEM 培養(yǎng)基按1∶3 稀釋 Matrigel，使其終濃度達到 1 mg/ml；將Transwell 小室放置于 24 孔板上，并加入 100 μl 稀釋的Matrigel，37℃ 孵育1 h 使膠完全凝固（注：侵襲實驗需此步固化小室，遷移實驗略過此步）。加入5×104個肝癌細胞 SMMC-7721 100 μl（5%FBS 培養(yǎng)基制備）于小室上室中，并加600 μl含10%FBS 的培養(yǎng)基于Transwell 的下室，孵育48 h 后，洗滌，染色，將小室置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9 BAZ2A 真核基因表達載體的構(gòu)建 以肝癌細胞SMMC-7721 提取RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 為模板，建立PCR 擴增體系，PCR 產(chǎn)物凝膠回收后，BamHⅠ與XbalⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)雙酶切的pcDNA3.1回收產(chǎn)物連接構(gòu)建BAZ2A高表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BAZ2A。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理。實驗組間統(tǒng)計分析采用配對t檢驗。統(tǒng)計結(jié)果認定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細胞miR-100 水平定量檢測 提取細胞RNA，采用熒光定量PCR 法檢測肝癌細胞中miR-100 的表達水平，人正常肝細胞HL-7702 做參照。結(jié)果顯示（圖1），相對于正常肝細胞，miR-100 在肝癌細胞中表達減少，尤其在肝癌細胞SMMC-7721中。

圖1 miR-100在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達差異Fig.1 Expression of miR-100 in liver cancer cells and normal hepatocytes

2.2 miR-100 對 BAZ2A 表 達 的 影 響 miR-100 mimics 50 nmol/L 轉(zhuǎn)染肝癌細胞 SMMC-7721 48 h 后（設(shè)置陰性對照NC），通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，miR-100表達顯著升高（P＜0.01，圖2A），而BAZ2A mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05，圖2B）。Western blot分析結(jié)果顯示，miR-100 表達增高的情況下，BAZ2A表達越降低（圖2C）。

圖2 miR-100 mimics轉(zhuǎn)染肝癌細胞SMMC-7721對BAZ2A表達影響Fig.2 Effect of miR-100 mimics transfection on BAZ2A expression in hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721

2.3 BAZ2A 是miR-100 的靶基因檢測 miR-100與BAZ2A 3'UTR 有結(jié)合位點，將熒光重組質(zhì)粒與miR-100 mimics 共轉(zhuǎn)入HEK293T 細胞中，檢測細胞的熒光素酶活性。結(jié)果顯示（圖3），轉(zhuǎn)染miR-100 mimics組pmir-BAZ2A 3'UTR 熒光素酶活性較NC 組明顯降低（P＜0.05），而pmir-BAZ2A 3'UTR-mut熒光素酶活性miR-100 mimics 組與NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-100 與BAZ2A 3'UTR的結(jié)合能力Fig.3 Luciferase activity detected for binding capacity of miR-100 and BAZ2A 3'UTR

2.4 miR-100 對肝癌細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗顯示（圖4），SMMC-7721 細胞轉(zhuǎn)染miR-100 mimics 50 nmol/L 24 h 后，肝癌細胞的遷移水平與陰性對照（NC）組相比有所下降（P＜0.05），且48 h后下降更為明顯（P＜0.01）。miR-100 表達增強，BAZ2A的表達被抑制，肝癌細胞的遷移能力減弱。

圖4 miR-100對SMMC-7721細胞遷移能力影響Fig.4 Effect of miR-100 on SMMC-7721 cells migration

2.5 上調(diào)SMMC-7721 細胞中miR-100 的表達對肝癌細胞遷移侵襲能力的影響 肝癌細胞SMMC-7721轉(zhuǎn)染miR-100 mimics 50 nmol/L 48 h后，Transwell小室侵襲及遷移實驗結(jié)果顯示（圖5A、B），轉(zhuǎn)染組肝癌細胞的遷移侵襲數(shù)目明顯減少（P＜0.01）。在肝癌細胞中上調(diào)miR-100 的表達，可以明顯抑制肝癌細胞的遷移侵襲能力。

圖5 肝癌細胞株SMMC-7721轉(zhuǎn)染miR-100 mimics后細胞遷移侵襲實驗Fig.5 Migration and invasion of hepatoma cell line SMMC-7721 transfected with miR-100 mimics

2.6 BAZ2A 高表達可以對抗miR-100 對肝癌細胞的抑制作用 以上實驗結(jié)果顯示，在肝細胞中，miR-100 表達增高可以發(fā)揮抗腫瘤作用，且BAZ2A作為miR-100 的靶基因，實驗驗證當(dāng)高表達BAZ2A是否可以使miR-100 的抑癌作用減弱。將BAZ2A真核基因表達載體pcDNA3.1-BAZ2A 與miR-100 mimics 共轉(zhuǎn)入SMMC-7721 細胞中，劃痕和遷移侵襲實驗結(jié)果顯示（圖6），在轉(zhuǎn)染后48 h，miR-100 明顯抑制肝癌細胞的遷移和侵襲作用的同時（P＜0.01），加入BAZ2A 真核基因表達載體組的細胞遷移和侵襲能力均得以恢復(fù)，且與miR-100 轉(zhuǎn)染組有顯著性差異（P＜0.01）。綜上所示，miR-100 對肝癌細胞的遷移和侵襲能力的抑制可以體現(xiàn)在對靶基因BAZ2A的表達抑制。

圖6 肝癌細胞株SMMC-7721 共轉(zhuǎn)染miR-100 mimics 和BAZ2A cDNA后細胞遷移侵襲實驗Fig.6 Migration and invasion of hepatoma cell line SMMC-7721 transfected with miR-100 mimics and BAZ2A cDNA

3 討論

肝癌早期診斷難，晚期治療效果差，患者預(yù)后不佳，生存率低。深入了解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的治療靶點是肝癌研究方向之一。研究表明，miRNAs 參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控，miRNAs和其調(diào)控的靶基因在肝癌發(fā)展中的作用機制是肝癌研究的重要方面。

本研究前期工作中，研究者就6 種miRNA 靶基因在3 種肝癌細胞中的表達進行研究，篩選出3 種肝癌細胞中高表達基因，其中以BAZ2A 基因表達最高，目前研究資料顯示BAZ2A 是多種miRNAs 的靶基因，參與胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移機制中［5］。miRNA 通常與靶基因 mRNA 3'UTR區(qū)發(fā)生相互作用，進而關(guān)閉或抑制基因的表達。本研究通過TargetScan 篩選可與BAZ2A 基因 3'UTR結(jié)合，且在肝癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移機制中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵miRNAs，研究在肝癌細胞中miRNAs 及其靶基因BAZ2A 的表達變化對肝癌細胞增殖和遷移侵襲能力的影響，進而研究BAZ2A 基因在肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移中的作用和機制。篩選結(jié)果顯示，miR-100 可與BAZ2A 基因 mRNA 的 3'UTR 有一處結(jié)合位點，序列為UACGGGU。資料表明，miR-100可表現(xiàn)抑癌基因的作用，在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，還能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［6-13］。miR-100 可調(diào)控在肝癌中高表達的BAZ2A 基因，miR-100 有望成為肝癌治療的新靶點及預(yù)測預(yù)后的新分子標(biāo)記。

綜上所述，以肝癌中高表達的靶基因BAZ2A，反向篩選出腫瘤特異性的miRNA，通過熒光定量法驗證所選miR-100 在肝癌細胞中的表達，熒光素酶活性檢測法驗證了miR-100 對靶基因BAZ2A 的作用。一方面，過表達miR-100 可抑制BAZ2A 在肝癌細胞中的表達水平，同時削弱肝癌細胞的生長，遷移和侵襲能力，另一方面，BAZ2A 過表達也使miR-100 在肝癌細胞中的抗腫瘤作用得以部分恢復(fù)。在肝癌細胞中上調(diào)miR-100的表達可以通過直接抑制BAZ2A 的表達而影響肝癌細胞的遷移侵襲。后續(xù)實驗將開展研究miRNA inhibitor和干擾腫瘤中靶基因表達對腫瘤遷移侵襲的作用。