楊 毅 張莉晶 孫龍飛 姜海兵

近年來隨著疾病診斷技術(shù)及國民經(jīng)濟(jì)水平的提升，越來越多的健康問題被揭示。我國目前有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)患者1100余萬，其發(fā)生率及病死率仍處于上升階段[1]。雖然CAD的診療手段層出不窮，但仍無法早期準(zhǔn)確判斷其發(fā)病，因此，尋找新診療靶點(diǎn)極其重要。近年來，研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與調(diào)控細(xì)胞眾多生理、病理環(huán)節(jié)，并且在心血管疾病方面發(fā)揮著重要作用。lncRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的特殊RNA，長度超過200個(gè)核苷酸。研究證實(shí)，lncRNA H19和LIPCAR血漿水平的升高與CAD風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[2]。Xu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，CAD患者lncRNA IFNG-AS1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與患者血清TNF-α、IL-1、IL-6、hs-CRP等炎性因子水平呈正相關(guān)。此外，Cai等[4]研究發(fā)現(xiàn)CAD患者lncRNA CoroMarker在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高。

本課題組在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中再次驗(yàn)證lncRNA IFNG-AS1在CAD患者中呈現(xiàn)高表達(dá)。此后在后期擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測了該lncRNA及另外兩種文獻(xiàn)報(bào)道與CAD炎癥密切相關(guān)的lncRNA AF131217.1以及l(fā)ncRNA CoroMarker，并觀察是否上述lncRNA與IL-6、TNF-α的血清水平相關(guān)，探討上述3種lncRNA可否作為CAD新的診斷指標(biāo)，及其與冠張動(dòng)脈粥樣硬化的炎性反應(yīng)的作用及意義。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：入選2019年3月～2020年9月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院行擇期冠狀動(dòng)脈造影符合 CAD診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者共40例作為病例組，同時(shí)入選同期造影正常者作為對(duì)照組，共40例。所有患者簽署知情同意，研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～80歲，行冠狀動(dòng)脈造影明確或?yàn)楣谛牟』蛎鞔_為冠狀動(dòng)脈正常患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他冠狀動(dòng)脈病變；②心臟瓣膜病、心肌病等其他心臟病變；③急性炎癥性疾??；④免疫系統(tǒng)疾病。

2.CAD診斷標(biāo)準(zhǔn):擇期冠狀動(dòng)脈造影，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)制定的慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南，即任一心外膜冠脈血管直徑狹窄超過50%且有心絞痛或無創(chuàng)性檢查顯示患者有心肌缺血證據(jù)者[5]。

3.觀察指標(biāo)：(1)患者入組時(shí)一般特征，包括性別、年齡、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、是否吸煙、低密度脂蛋白、合并癥等情況。(2)外周血IL-6、TNF-α水平。(3)外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1和lncRNA CoroMarker表達(dá)水平。

4.主要試劑和儀器：AU689 全自動(dòng)生化分析儀(美國BechmauConlter公司)；PCR擴(kuò)增引物(新疆歐易生物科技有限公司)合成；RT-PCR儀(美國Applied Biosystems公司，儀器型號(hào)：MasterMix-LR/1051845151001)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑(北京艾可莘生物科技優(yōu)秀公司)。

5.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:手術(shù)當(dāng)日，晨起采集空腹靜脈血4ml于EDTA抗凝管中，控溫離心機(jī)4℃、3000r/min離心血液樣本10min，上層血漿樣本檢測低密度脂蛋白膽固醇及IL-6、TNF-α；離心下層提取單核細(xì)胞中的RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1和lncRNA CoroMarker。

6.實(shí)驗(yàn)步驟：(1)RNA提取步驟及反轉(zhuǎn)錄:分離PBMC樣本，使用Trizol法提取RNA，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明：各樣品均取800ng RNA，隨機(jī)引物(0.1μg/μl)1μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 10μl，TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1μl補(bǔ)DDW至20μl；65°水浴5min后迅速至冰上，加入5X緩沖液4μl，RNA酶抑制劑1μl，RT 1μl，DNTP 2μl 42℃孵育1h 70℃孵育5min后冰上冷卻即完成反轉(zhuǎn)錄。(2)RT-PCR法檢測PBMC中IFNG-AS1、AF131217.1及CoroMarker表達(dá)情況，通過Genebank中IFNG-AS1、AF131217.1、CoroMarker序列，使用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)用PCR引物序列及擴(kuò)增片段大小

結(jié) 果

1.一般資料比較:病例組40例，其中男性32例，女性8例，患者年齡56.4±6.5歲；對(duì)照組40例，其中男性30例，女性10例，患者年齡57.8±5.9歲。兩組患者在性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙、低密度脂蛋白、合并癥等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

2.兩組IL-6、TNF-α比較：IL-6病例組2.91±0.33pg/ml，高于對(duì)照組1.07±0.10pg/ml(P<0.05)，TNF-α病例組46.31±1.81pg/ml，高于對(duì)照組34.18±1.04pg/ml(P<0.05,表3)。

表3 兩組患者分析指標(biāo)比較

3.兩組患者行冠脈造影術(shù)前服藥對(duì)比:病例組及對(duì)照組在抗血小板藥物(包括阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、吲哚布芬)、倍他受體阻滯劑(β-blocker)、他汀(Statin)、鈣拮抗劑(CCB)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ACEI/ARB)使用情況組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表4 兩組患者用藥情況對(duì)比[n(%)]

4.lncRNA表達(dá):qRT-PCR表明，CAD病例組患者lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，無明顯增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，lncRNA CoroMarker表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 3種lncRNA 在病例組與對(duì)照組PBMC中的表達(dá)

5.ROC曲線結(jié)果:lncRNA IFNG-AS1的AUC為0.360，lncRNA AF131217.1的AUC為0.445，在本研究中對(duì)冠心病不具有診斷意義。lncRNA CoroMarker的AUC為0.960，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.026，95%CI：0.908～1.000(P=0.000)，同時(shí)結(jié)果還顯示lncRNA CoroMarker診斷CAD敏感度和特異性分別為90.0%和90.0%，cut-off值為1.081，詳見圖2。

圖2 3種lncRNA診斷CAD的ROC曲線

6.CAD組lncRNA CoroMarker與IL-6、TNF-α相關(guān)性分析：CAD組外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CoroMarker與血漿IL-6呈線性正相關(guān)(r=0.437，P=0.005)，與血漿TNF-α呈線性正相關(guān)(r=0.740，P=0.000)，詳見圖3。

圖3 觀察組lncRNA CoroMarker與IL-6、TNF-α相關(guān)性比較

討 論

冠心病危險(xiǎn)因素眾多，除了血脂異常、高血糖、高血壓、肥胖、吸煙等，也與炎性損傷及炎性介質(zhì)密切相關(guān)，IL-6、TNF-α是傳統(tǒng)炎性標(biāo)志物，與冠心病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[6～8]。本研究發(fā)現(xiàn)CAD患者IL-6、TNF-α明顯高于對(duì)照組，說明IL-6、TNF-α在動(dòng)脈硬化發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用。但傳統(tǒng)炎性標(biāo)志物與長鏈非編碼RNA有無相關(guān)性，具體如何影響，目前仍不明確。

lncRNAs參與調(diào)控細(xì)胞眾多生理、病理環(huán)節(jié)，前述研究發(fā)現(xiàn)CAD患者lncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1、lncRNA CoroMarker明顯升高[2～4]。李文杰等[9]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清lncRNA UCA1在老年冠心病患者中低表達(dá)，且與低密度脂蛋白膽固醇、Gensini評(píng)分、預(yù)后情況有關(guān)。張浩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，冠脈介入術(shù)后再狹窄組患者血清lncRNA MIR155HG表達(dá)水平明顯升高，與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，對(duì)冠心病患者PCI后冠狀動(dòng)脈再狹窄具有一定診斷價(jià)值。李孟婷等[11]研究顯示lncRNA TUG1可能通過改變炎性因子表達(dá)水平從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程。可見lncRNAs參與冠心病的機(jī)制比較復(fù)雜。同時(shí)更有研究顯示在服用氯吡格雷作為冠心病二級(jí)預(yù)防用藥的患者中，lncRNA表達(dá)的差異與患者氯吡格雷抵抗及患者的長期預(yù)后相關(guān)[12]。

本研究中l(wèi)ncRNA IFNG-AS1、lncRNA AF131217.1沒有發(fā)現(xiàn)明顯的高表達(dá)，可能與研究樣本量較小、研究入選人群不同、合并疾病與相關(guān)研究不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組患者lncRNA CoroMarker明顯高于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果一致[13]。lncRNA CoroMarker診斷冠心病的AUC為0.960,標(biāo)準(zhǔn)誤為0.026，95%CI為0.908～1.000(P=0.000)。CoroMarker診斷CAD敏感度和特異性分別為90.0%和90.0%，cut-off值為1.081。在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，患者IL-6、TNF-α隨著lncRNA CoroMarker的升高而升高，呈現(xiàn)線性正相關(guān)(r=0.437，P=0.005)。考慮lncRNA CoroMarker可能通過炎性通路影響了IL-6、TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)了CAD患者的發(fā)生、發(fā)展，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，在CAD患者血清單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CoroMarker差異性高表達(dá)，對(duì)CAD的診斷具有較高的敏感度及特異性，具有成為診斷CAD及評(píng)估病情嚴(yán)重程度的生物學(xué)標(biāo)志物的潛能，與IL-6、TNF-α水平呈線性正相關(guān)，考慮lncRNA CoroMarker通過炎性通路促進(jìn)CAD的發(fā)生、發(fā)展。