張 偉 李詠潔 楊鳳梅 李艷艷 靳瑋華 徐鴻界 李明學 劉 權(quán) 趙 遠 和占龍

柯薩奇B組病毒是一種能引起嬰幼兒手足口病的病原，在2008年后該類病原被列入中國疾病預防控制信息系統(tǒng)的疾病監(jiān)測范圍[1]。柯薩奇病毒B3屬小RNA病毒科，腸道病毒屬B組，臨床上大量腸道病毒感染并發(fā)癥如病毒性心肌炎的報告與柯薩奇B3密切相關，而根據(jù)病毒性心肌炎的診療指南指出：目前該疾病的診斷主要依靠臨床癥狀、心電圖、血清心肌酶等影像學及血液生化指標判定，這對急性、亞急性及重癥病毒性心肌炎患者而言存在診療的滯后性[2]。對于該病毒的感染并無特殊治療方法，主要采取對癥治療，因此基于以上背景，本研究擬建立起敏感、特異、低成本的CV-B3分子檢測方法，以期望對臨床上該病原的檢測提供參考。

材料與方法

1.材料:CV-B3、CV-A10、CV-A6及EV-71病原由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所遺傳室馬紹輝教授和呼吸道病毒研究室劉龍丁教授惠贈。其中CV-B3經(jīng)Vero細胞增殖培養(yǎng)后，所收獲的病毒液經(jīng)純化測定細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量即感染性效價(cell culture infective dose 50%，CCID50)為1×106.75CCID50/ml，分裝保存于筆者所在科室；病毒培養(yǎng)及保存溶液均為細胞維持液(表1)，配制所需成分均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所中心供應室提供；Vero細胞來源于歐洲動物細胞收藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC)第141代，保存于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所；感受態(tài)細胞(JM109)、T載體(pMD19-T)、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(Prime Script TM One Step RT-PCR Kit)、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 (in vitro Transcription T7 Kit)、一步法熒光定量PCR試劑盒(One Step TB Green?PrimeScript?PLUS RT-PCR Kit)及DNA末端加A試劑盒(DNA A-Tailing Kit)購自大連寶日醫(yī)生物工程有限公司，無內(nèi)毒素小提中量質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物有限公司；C1000型 PCR 儀、C1000 TouchTMThermal Cycler 實時熒光定量PCR儀及凝膠成像儀購自美國伯樂生物科技公司。

表1 細胞生長液、病毒培養(yǎng)及細胞維持液(病毒保存液)配制

2.引物設計與合成:使用柯薩奇B組病毒通用引物對病毒進行擴增后測序，通過MEGA7軟件對測序結(jié)果與GeneBank中CV-B3毒株序列進行比對，選取該毒株的VP1序列并利用Oligo7軟件設計該段序列的T7啟動子引物(VP1-T7)及熒光定量PCR引物，引物序列詳見表2，引物由昆明擎科生物公司合成。

表2 引物序列

3.標準品的構(gòu)建:使用Trizol法提取病毒總RNA，經(jīng)通用引物和特異性引物VP1-T7進行RT-PCR后，獲得該病原的帶有T7啟動子的VP1基因，使用DNA A-Tailing試劑盒、pMD19-T 克隆載體對獲取的VP1基因3′末端添加A尾并連接至T載體上，構(gòu)建VP1基因的重組質(zhì)粒；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109 感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選后挑取含有陽性克隆的白色菌落，放入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min 培養(yǎng)12h后，測序驗證并提取陽性克隆質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行單酶切線性化后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行純化并回收獲得大小為3508bp的線性化重組質(zhì)粒；使用in vitro Transcription T7 Kit試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA，同時對轉(zhuǎn)錄的RNA使用水飽和酚/氯仿(1∶1)、乙酸鈉(NaAC)進行RNA精制，獲得的標準品用超微量分光光度計進行濃度與純度測定并計算標準品的拷貝數(shù)。

4.熒光定量(RT-qPCR)檢測方法的建立:①優(yōu)化反應體系：對反應體系的引物濃度以及反應條件進行優(yōu)化，最終以無二聚體、熒光信號強、背景噪音小為判斷標準，確定最佳的反應體系;②標準曲線的建立：對獲得的標準品進行10倍梯度稀釋，取10～109拷貝/微升標準品稀釋液9個梯度，設立陰性對照并使用上述優(yōu)化后的反應體系和條件進行SYBR Green Ⅰ RT-PCR反應，繪制出標準曲線;③特異性檢測：使用上述優(yōu)化后的反應體系分別對EV-71、CV-A6、CV-A10的病毒核酸進行檢測，驗證檢測體系的特異性;④敏感度檢測：將CV-B3的標準品按10倍梯度稀釋(10～109拷貝/微升)，使用建立的SYBR Green Ⅰ RT-PCR 方法進行檢測，評價其對病毒核酸檢測的敏感度;⑤重復性檢測：將CV-B3病毒接種于Vero細胞后，分別于感染后的0、4、8、12、20、28、36、48、60、72h收集樣本并提取RNA，進行SYBR Green Ⅰ RT-PCR，每個樣本做3次重復，觀察組內(nèi)重復性。

結(jié) 果

1.CV-B3病毒VP1基因序列的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建:通用引物擴增CV-B3核酸后獲得1132bp的基因片段(圖1A)與CV-B3原始毒株序列比對，其序列一致性為94%；特異性引物VP1-T7擴增CV-B3VP1基因獲得816bp的基因片段(圖1B)；重組質(zhì)粒經(jīng)ECOR-Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶進行單酶切后獲得3508bp的線性化重組質(zhì)粒(圖1C)，同時對重組質(zhì)粒測序結(jié)果與通用引物產(chǎn)物序列比對，其一致性為99%。以上結(jié)果提示成功克隆了該病原的VP1基因，構(gòu)建了該病原的重組質(zhì)粒。

圖1 通用引物擴增產(chǎn)物、VP1 特異性引物擴增產(chǎn)物、重組質(zhì)粒電泳結(jié)果A.通用引物擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果(1、2為產(chǎn)物，M為2000DNA marker)； B. CV-B3的VP1片段(1、2為產(chǎn)物，M為2000DNA marker)；C.酶切線性化的質(zhì)粒和環(huán)狀質(zhì)粒(1、2 為產(chǎn)物，M為5000DNA marker)

2.最優(yōu)熒光定量PCR反應體系的確立:對引物濃度以及反應條件摸索，最終確定了引物最佳濃度為10μmol/L，最佳退火溫度為60℃。最終確定了SYBR Green Ⅰ RT-PCR 反應體系(表3)，反應條件為：42℃ 5min，94℃ 10s，95℃ 5s，60℃ 30s，共39個循環(huán)，65℃ 5s，95℃ 5s進行溶解曲線反應。

表3 SYBR Green Ⅰ RT-PCR 反應體系

3.標準曲線的建立:將單酶切線性化的重組質(zhì)粒經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度，按照10倍梯度將標準品稀釋為10～109拷貝/微升的標準品模板，利用上述優(yōu)化好的PCR反應體系進行熒光定量PCR反應，并得到標準曲線、擴增曲線、溶解曲線和特異性檢測擴增曲線，詳見圖2。得到的CV-B3熒光定量PCR標準曲線方程為y=-3.3843x+37.529,r2=0.999 擴增效率為95.7%。

4.特異性評價:使用建立起的檢測方法對CV-B3、CV-A6、CV-A10、EV-71的病毒RNA進行擴增(圖2D)。該方法只能特異性地檢測CV-B3的核酸，而對CV-A6、CV-A10、EV-71的核酸均未檢測到熒光信號，提示該方法對檢測本株CV-B3具有較好的特異性。

圖2 SYBR Green Ⅰ RT-PCR 反應體系標準曲線的建立及評價A.標準曲線；B.擴增曲線；C.溶解曲線；D.特異性檢測

5.敏感度評價:使用該方法檢測標準品，結(jié)果顯示：在10～109拷貝/微升范圍內(nèi)，可出現(xiàn)較好的擴增曲線，因此建立的SYBR Green Ⅰ RT-PCR 方法的最低檢測限為10拷貝/微升。

6.重復性評價:取接種CV-B3后0、4、8、12、20、28、36、48、60和72h 的Vero細胞樣本，提取RNA后使用上述檢測方法對不同時間點的樣本進行獨立3次重復實驗，實驗結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明各組重復性實驗變異系數(shù)均<2%，提示該檢測方法具有良好的重復性。

表4 SYBR Green Ⅰ RT-PCR檢測體系重復性評價

討 論

根據(jù)歐洲及國內(nèi)相關地區(qū)2008～2017年的流行病學調(diào)查報告指出：國內(nèi)外腸道病毒流行病學病原譜正在逐步發(fā)生改變，這在一定程度上增加了腸道病毒感染患者的診治難度[3，4]。而CV-B3對心血管系統(tǒng)極高的趨向性和破壞性提示該病原的預防及診治應當引起足夠的重視。因此建立起一種快速、敏感、特異、成本低廉且能完成分型的檢測方法對于臨床診斷及傳染病防治工作具有重大意義。

臨床上對于腸道病毒感染的檢測，使用較多的主要有病毒的分離培養(yǎng)、血清特異性中和抗體檢測、ELISA檢測、核酸檢測等[5]。其中中和抗體檢測以及ELISA操作較為繁雜、診斷結(jié)果存在假陰性，而病毒分離培養(yǎng)對于操作人員需要極高的生物安全防護意識，同時需要具備二級生物安全實驗室的實驗條件，對于臨床患者的診斷而言存在極大的滯后，因此目前的主流檢測方法主要是病毒核酸檢測。而核酸檢測主要分為常規(guī)的核酸檢測及熒光定量核酸檢測，常規(guī)核酸檢測需要在PCR結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其操作繁瑣易污染，同時只能進行定性檢測。而熒光定量核酸檢測則不需要電泳鑒定，同時對于病毒載量極低的臨床樣本仍然能夠檢出[6]。新型生物技術(shù)的開發(fā)與利用，使得腸道病毒的檢測不再局限于核酸檢測，目前報道較多的有反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、新一代測序技術(shù)(NGS)等[7，8]。盡管這些檢測方法樣本通量大、效率高，但其對實驗設備要求較復雜，需要設計各種昂貴的分子探針等[9]。而SYBR Green Ⅰ RT-PCR檢測方法并不需要合成探針，且并無特殊設備要求。SYBR Green Ⅰ方法檢測成本低廉，染料與DNA結(jié)合后，目的片段的擴增可通過熒光強度進行判斷，而擴增片段的統(tǒng)一性、特異性以及是否存在引物二聚體可通過溶解曲線的溫度分布來判斷[10，11]。同時染料法熒光定量檢測也存在一定的不足之處，如該方法會產(chǎn)生錯誤的單鏈二級結(jié)構(gòu)等。但是腸道病毒血清型眾多,設計探針成本較高，同時易感人群基數(shù)龐大等，這在一定程度上給病原檢測帶來較大難度，因此綜合檢測效率、敏感度、特異性及成本考慮，SYBR Green Ⅰ不失為一種較好的檢測方法[12]。

另外有研究報道建立起了CV-B3的TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR 檢測方法[13，14]。雖然TaqMan探針法熒光定量較于染料法熒光定量敏感度更高，但是探針的設計及合成成本較于染料更為昂貴且易污染，同時在以上研究報道中，研究者均未將建立的標準品轉(zhuǎn)錄成RNA，這就使得在樣品檢測過程中必須將樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行，這在一定程度上增加了檢測誤差[15,16]。而由于標準品載體骨架序列存在，也存在載體骨架序列影響樣本檢測準確性的可能。

基于此，本研究建立起了一種快速、敏感、特異、低成本的CV-B3 SYBR Green Ⅰ RT-PCR檢測方法。首先本實驗在建立標準品時，在該病原VP1克隆的基礎上對其5′端添加了T7啟動子，確保其在體外能夠成功轉(zhuǎn)錄成RNA，在一定程度上避免了載體骨架序列對檢測體系的干擾的可能性，提高了檢測準確性。同時基于T7啟動子，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進行了線性化處理，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得了病毒VP1基因RNA標準品，使得在檢測體系中可以將標準品與檢測樣本同時進行反應，降低了多步操作帶來的誤差。與此同時根據(jù)實驗結(jié)果對比，本實驗建立的檢測方法相較于前人研究具有更高的樣品檢測上限和檢測準確性。

綜上所述，本實驗建立的CV-B3 SYBR Green Ⅰ RT-PCR檢測方法具有良好的敏感度、特異性、重復性，可以為CV-B3臨床患者的快速診斷及臨床樣本的快速篩查提供參考。