姚 瑞 李亞彭 梁 翠 肖莉麗 張彥周 高 路

膿毒癥是重癥患者的常見死因，如果得不到及時(shí)有效的控制，膿毒癥會(huì)迅速發(fā)展成全身炎癥反應(yīng)綜合征，最終導(dǎo)致多器官功能障礙[1]。膿毒癥心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy，SIC)是膿毒癥多器官功能障礙的主要并發(fā)癥之一，一旦發(fā)生，病死率高達(dá)70%～90%[2, 3]。由于缺乏對其機(jī)制的深入理解，目前臨床上對SIC的治療仍缺乏特效藥。內(nèi)毒素引起的心肌細(xì)胞損傷和心肌細(xì)胞凋亡在多種心血管疾病的發(fā)病過程中具有重要作用，該機(jī)制會(huì)增加膿毒癥患者的病死率[3～5]。研究特異性針對心肌細(xì)胞損傷與凋亡的藥物可能用于靶向治療SIC。微小RNA(miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA，其長度約為22個(gè)核苷酸，可以與mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)結(jié)合，降解目的mRNA，抑制翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。大量研究已經(jīng)證實(shí)miRNA在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中意義重大[5, 6]。miR-22最初被認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抑制因子，近年來研究證實(shí)，miR-22參與心肌缺血再灌注、心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[7～9]。但是，目前涉及miR-22與SIC之間的研究甚少。本研究通過探討miR-22在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用和機(jī)制，旨在為膿毒癥心肌病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.主要試劑：所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自美國Gibco公司，免疫印跡所用一抗抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，LPS購自美國Sigma公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒構(gòu)自美國Promega公司，miR-22模擬序列(miR-22 mimics)、陰性對照序列(scramble control miRNA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建完成。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合率至80%以上時(shí)進(jìn)行傳代。取第3～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞分組：對照組：給予相同體積的PBS處理24h；LPS組：細(xì)胞采用1μg/ml LPS培養(yǎng)24h；miR-22模擬物+LPS(miR-22+LPS)組：采用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-22模擬物(miR-22 mimic)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6h后更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)8h，再加入1μg/ml LPS培養(yǎng)24h；miR-22陰性對照+LPS(miR-NC+LPS)組：采用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-22陰性對照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6h后更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)8h，再加入1μg/ml LPS培養(yǎng)24h。

4.MTT檢測心肌細(xì)胞活性：將細(xì)胞接種于96孔板中，經(jīng)處理后，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗后，每孔加入10μl MTT溶液，孵育4h后加入二甲基亞砜，10min后用酶標(biāo)儀檢測各孔在490nm處的吸光度。每組細(xì)胞活性(%)=(A處理-A對照)/A對照×100%。

5.TUNEL細(xì)胞凋亡分析：將細(xì)胞接種于24孔板中，經(jīng)處理后采用4%多聚甲醛固定10min，再用TritonX-100通透10min，PBS漂洗后按TUNEL操作說明書，在常溫下孵育TUNEL染色液1h，采用DAPI染色細(xì)胞核，細(xì)胞封片后在熒光顯微鏡下拍照。

6.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將含有miR-22結(jié)合位點(diǎn)的HMGB1 3′UTR序列及其突變體插入pCMV-Promoter載體熒光素酶報(bào)告基因下游，分別得到含野生型HMGB1 3′UTR的載體命名為HMGB1-WT，含突變型HMGB1 3′UTR的載體命名為HMGB1-MUT，將構(gòu)建好的質(zhì)粒分別與miR-22 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)：細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)處理后每孔加入1ml Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA。采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用TaKaRa熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6為miR-22的內(nèi)參，GAPDH為HMGB1的內(nèi)參。采用F=2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量分析。

8.Western blot法檢測：將各組細(xì)胞接種于10cm大皿，經(jīng)上述處理后每孔加入RIPA裂解液裂解提取總蛋白。采用BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜封閉后加入HMGB1、Bax、Bcl-2對應(yīng)一抗孵育，采用HRP標(biāo)記的二抗孵育。洗膜后ECL試劑盒顯影，用Image Lab軟件對條帶進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.miR-22和HMGB1在各組細(xì)胞中的表達(dá):miR-22在LPS組的表達(dá)明顯低于對照組；與LPS組比較，miR-22+LPS組miR-22表達(dá)顯著升高。HMGB1的mRNA和蛋白水平在LPS組都明顯高于對照組；與LPS組比較，miR-22+LPS組HMGB1的mRNA和蛋白水平顯著下降，詳見圖1、表1。

表1 miR-22和HMGB1在心肌細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 HMGB1蛋白的表達(dá)1.對照組；2.LPS組；3.miR-22+LPS組；4.miR-NC+LPS組

2.miR-22在H9c2中對細(xì)胞活性的影響：MTT法檢測結(jié)果顯示，對照組、LPS組、miR-22+LPS組、miR-NC+LPS組細(xì)胞活性分別為100.0%±7.1%、53.2%±3.1%、79.5%±4.9%、59.1%±2.6%。LPS組、miR-22+LPS組及miR-NC+LPS組H9c2的細(xì)胞活性顯著低于對照組(P均<0.05)；與LPS組比較，miR-22+LPS組H9c2細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。

3.miR-22在H9c2中對細(xì)胞凋亡的影響:TUNEL染色結(jié)果顯示，對照組、LPS組、miR-22+LPS組和miR-NC+LPS組凋亡率分別為2.9%±1.1%、23.2%±3.5%、8.0%±1.6%和23.4%±4.2%(P<0.05)。LPS組、miR-22+LPS組和miR-NC+LPS組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P均<0.05)；miR-22+LPS組細(xì)胞凋亡率較LPS組明顯降低(P<0.05)，詳見圖2。

4.miR-22對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS組Bax表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯下降；與LPS組比較，miR-22+LPS組Bax表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著升高，詳見圖3、表2。

圖2 miR-22對LPS誘導(dǎo)下H9c2細(xì)胞凋亡的影響(×400)A.對照組；B.LPS組；C.miR-22+LPS組；D.miR-NC+LPS組

圖3 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)1.對照組；2.LPS組；3.miR-22+LPS組；4.miR-NC+LPS組

表2 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

5.miR-22調(diào)控HMGB1的表達(dá)：Target Scan預(yù)測結(jié)果表明HMGB1的3′UTR上存在miR-22的結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。將miR-NC mimcis和miR-22 mimics分別與HMGB1-WT共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性分別為1.04±0.07、0.42±0.03，miR-22組HMGB1-WT活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；而miR-NC mimics和miR-22 mimics分別與HMGB1-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性分別為1.03±0.08、0.97±0.06，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 HMGB1的3′UTR中含有與miR-22互補(bǔ)的核苷酸序列

討 論

SIC是重癥監(jiān)護(hù)病房膿毒癥患者最常見的死亡原因之一。LPS是革蘭陰性細(xì)菌的主要結(jié)構(gòu)組成部分，可誘發(fā)膿毒癥，其中心肌功能障礙是公認(rèn)的主要表現(xiàn)之一，本研究以LPS刺激心肌細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型以模擬SIC[2]。在LPS誘導(dǎo)的心肌損傷中，細(xì)胞壞死和凋亡是細(xì)胞損傷的主要過程。在心肌損傷早期細(xì)胞損傷多以細(xì)胞凋亡的形式開始，因此早期抑制細(xì)胞凋亡有助于及時(shí)阻止細(xì)胞損傷、減少細(xì)胞數(shù)量的丟失，恢復(fù)心臟功能[3,4]。

miR-22是位于人17號染色體上的非編碼短鏈小RNA，由22個(gè)核苷酸組成，在心肌細(xì)胞中高表達(dá)[10]。miR-22參與細(xì)胞增殖分化、凋亡、自噬、纖維化等多種生物學(xué)功能的調(diào)控[11]。miR-22在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。在缺血心肌中，miR-22通過減少炎性反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用[12]；在糖尿病心肌病中，miR-22通過調(diào)控Sirt1的表達(dá)減少心肌氧化應(yīng)激損傷[13]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-22通過抑制NLRP3的表達(dá)減輕炎性反應(yīng)[14]。本研究采用H9c2心肌細(xì)胞，以LPS刺激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，通過MTT分析研究miR-22對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，結(jié)果顯示用LPS處理后細(xì)胞活力減低，但是，當(dāng)采用miR-22 mimics在心肌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-22，結(jié)果顯示細(xì)胞過表達(dá)miR-22可以大大降低細(xì)胞活力的損失。Western blot法檢測結(jié)果顯示LPS處理心肌細(xì)胞后，Bcl-2/Bax比值顯著下降，而miR-22+LPS組Bcl-2/Bax比值顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡顯著改善。這些結(jié)果表明，miR-22在心肌細(xì)胞中可能有增強(qiáng)細(xì)胞活力和抗凋亡的作用，上調(diào)miR-22表達(dá)可能有利于心肌細(xì)胞生存。

通過生物信息學(xué)預(yù)測HMGB1是miR-22潛在靶基因，雙光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明HMGB1是miR-22的直接靶基因。HMGB1蛋白是一種非組蛋白核蛋白，具有穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)、DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)膽固醇等作用。大量研究已經(jīng)證實(shí)，HMGB1在多種心血管疾病特別是心肌梗死、心肌肥厚和心肌炎等疾病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[15, 16]。既往研究表明，靶向沉默HMGB1可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[17]。本研究結(jié)果顯示，在LPS處理的H9c2細(xì)胞中，過表達(dá)miR-22抑制了HMGB1的蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了HMGB1的mRNA水平。因此，推測miR-22通過負(fù)性調(diào)控HMGB1的轉(zhuǎn)錄抑制HMGB1的釋放，從而減少心肌細(xì)胞對LPS的損傷反應(yīng)。

綜上所述，本研究利用LPS誘導(dǎo)建立H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示miR-22在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中表達(dá)降低，并且證實(shí)高表達(dá)的miR-22能夠下調(diào)HMGB1的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，使得細(xì)胞活力顯著升高，降低細(xì)胞凋亡，表明miR-22對LPS造成的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本研究為探索miR-22的具體作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為預(yù)防并干預(yù)膿毒癥和SIC提供了新思路。