盛立柱，謝良明，葉曉菊，何建芬，廖加貴，文冬華，林火松

（1.龍泉市食藥用菌產(chǎn)業(yè)辦公室，浙江 龍泉 323700；2.龍泉市張良明菌種場(chǎng)，浙江 龍泉 323700；3.龍泉市麗佳食用菌菌棒專業(yè)合作社，浙江 龍泉 323700）

靈芝（Ganoderma lingzhi）俗稱靈芝草、仙草、瑞草等[1]，隸屬于真菌門（Mycobionta） 擔(dān)子菌綱（Ba sidiomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 靈芝科（Ganodermataceae） 靈芝屬（Ganoderma）。靈芝是著名的食（藥）用真菌，藥用歷史已有2 000多年，因具有多種藥用價(jià)值而被歷代醫(yī)藥學(xué)家視為滋補(bǔ)壯體、扶正固本的神奇珍品[2]。

我國(guó)靈芝栽培主要有2種模式，一種是段木靈芝栽培，另一種是代料靈芝栽培，目前以段木栽培為主，產(chǎn)地主要有浙江、安徽、福建、東北、四川、貴州等地[3]。段木靈芝栽培需要消耗大量的木材，且生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，耗時(shí)耗力，栽培過(guò)程需要覆土，隨著栽培年限的積累，土壤栽培環(huán)境不斷變化，靈芝栽培出現(xiàn)連作障礙，因此段木靈芝栽培需要每2年更換一次栽培場(chǎng)地，無(wú)形中增加了生產(chǎn)成本。靈芝代料栽培主要分布在華北地區(qū)，其模式已經(jīng)十分普遍，但總體上我國(guó)靈芝的代料栽培多數(shù)采用分散式、手工式栽培模式，各地區(qū)生產(chǎn)水平不同，生產(chǎn)方式粗放，設(shè)施相對(duì)簡(jiǎn)陋，生產(chǎn)規(guī)模小，品質(zhì)參差不齊，經(jīng)濟(jì)效益低[4]。

靈芝的藥用價(jià)值來(lái)自其孢子粉，近年來(lái)研究表明靈芝的主要生理活性成分有靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)、多肽、核苷類、呋喃類、甾醇、生物堿和氨基酸等，而靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝孢子粉的重要有效成分[5]，不同靈芝品種中靈芝多糖和三萜含量不同，相同品種在不同栽培基質(zhì)中的靈芝多糖和三萜含量差異較大[6]。因此靈芝孢子粉的產(chǎn)量以及孢子粉中多糖和三萜類化合物的含量成為評(píng)價(jià)靈芝品種優(yōu)劣的重要指標(biāo)[7]。

隨著大健康產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，靈芝栽培技術(shù)的不斷提升，以及對(duì)靈芝產(chǎn)品更深層次的開發(fā)利用，消費(fèi)者對(duì)靈芝功效的認(rèn)可度也逐漸提升，需求量日益增加。傳統(tǒng)的分散式、手工式栽培模式已經(jīng)無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求，故靈芝工廠化栽培是靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向。靈芝工廠化栽培采用代料栽培模式，根據(jù)靈芝的適宜生長(zhǎng)條件，采用數(shù)字化智能系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和調(diào)控栽培環(huán)境條件，大批量、多批次地生產(chǎn)靈芝。避免靈芝栽培受季節(jié)、環(huán)境因素的影響，解決重金屬殘留、靈芝栽培連作障礙等問(wèn)題。合理利用森林資源，滿足更大的市場(chǎng)需求，實(shí)現(xiàn)全年無(wú)間歇、高品質(zhì)、高產(chǎn)能的靈芝生產(chǎn)。因此，通過(guò)試驗(yàn)篩選出適宜的靈芝代料栽培菌株品種，為靈芝工廠化栽培提供優(yōu)勢(shì)菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：美芝、韓芝、日芝、角芝、泰山、113、X16、滬農(nóng)1號(hào)共8個(gè)菌株，均來(lái)自龍泉市張良明菌種場(chǎng)。

菌袋：原種和栽培種菌袋為15 cm×29 cm×0.05 cm聚乙烯菌袋，生產(chǎn)菌袋為18 cm×42 cm×0.05 cm的聚乙烯菌袋。

PDA試管培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，水定容至1 L。

原種和栽培種培養(yǎng)料配方：木屑80%、棉籽殼10%、麩皮8.5%、石膏粉1%、紅糖0.5%，水60%～65%。

生產(chǎn)栽培配方：木屑88.5%、麩皮10%、石膏粉1%、紅糖0.5%，水60%～65%，每袋干重0.7 kg～0.8 kg。

栽培場(chǎng)所：標(biāo)準(zhǔn)化鋼架養(yǎng)菌大棚。

試驗(yàn)儀器：SE602FZH分析天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；UV1102Ⅱ759分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；DK-S24電熱水浴鍋，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；JY92-IIN超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R離心機(jī)，廣州碩譜生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種的制備

制作PDA試管培養(yǎng)基50支，121℃高壓滅菌30 min后制成試管斜面。隨機(jī)抽取5支滅菌后的試管，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃空培養(yǎng)48 h，觀察試管是否有雜菌污染，未污染方可使用。每個(gè)供試菌株在無(wú)菌環(huán)境下各接種3支試管，標(biāo)記好標(biāo)簽，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃培養(yǎng)，隨時(shí)觀察菌絲體顏色變化情況，及時(shí)觀察雜菌污染情況。待菌絲長(zhǎng)到試管斜面2/3，轉(zhuǎn)接原種。

1.2.2 原種的制備

將配制好的原種培養(yǎng)料裝入原種菌袋內(nèi)，封口后121℃高壓滅菌，待溫度升至121℃后保溫2.5 h，冷卻降溫至約28℃進(jìn)行接種。挑選菌絲體潔白濃密的母種試管，每支供試菌株的母種試管分別挑取直徑為0.5 cm的菌塊，分別接種到4個(gè)原種菌袋，標(biāo)記好標(biāo)簽，于25℃室內(nèi)層架培養(yǎng)，待原種長(zhǎng)滿菌袋后，方可接種栽培種。

1.2.3 栽培種的制備

將配制好的栽培種培養(yǎng)料裝入栽培種菌袋內(nèi)，封口后于121℃高壓滅菌，待溫度升至121℃后保溫2.5 h。冷卻降溫至約28℃后在無(wú)菌環(huán)境下接種，每個(gè)原種菌袋約可接種40個(gè)栽培種菌袋。每個(gè)供試菌株接種12個(gè)栽培種菌袋，標(biāo)記好標(biāo)簽，后放置于培養(yǎng)室內(nèi)層架培養(yǎng)并觀察栽培種菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，隨時(shí)取出污染的栽培種菌袋。

1.2.4 生產(chǎn)菌包的制備

將配制好的生產(chǎn)栽培配方裝入生產(chǎn)菌袋內(nèi)，于121℃高壓滅菌，待溫度升至121℃后保溫2.5 h，冷卻降溫至約28℃后可接種。每袋栽培種約可接種40個(gè)生產(chǎn)菌袋，每個(gè)菌株設(shè)計(jì)3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)90袋，標(biāo)記好標(biāo)簽，放置于培養(yǎng)室內(nèi)層架培養(yǎng)，溫度控制在22℃～25℃，濕度控制在60%～65%。

1.2.5 菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)和菌包成活率統(tǒng)計(jì)

每天觀察一次菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，隨時(shí)剔除污染菌包。記錄每個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)情況、發(fā)菌天數(shù)、成活率等。

1.2.6 出芝管理及試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集記錄

栽培場(chǎng)所提前用生石灰消毒，大棚頂部用次氯酸鈉消毒，并通風(fēng)晾曬3 d，將發(fā)滿菌的生產(chǎn)菌包放置于標(biāo)準(zhǔn)鋼架大棚內(nèi)，每個(gè)供試菌株的生產(chǎn)菌包分區(qū)塊放置，并做好試驗(yàn)標(biāo)記。出芝過(guò)程進(jìn)行光照、水分、通風(fēng)、降溫等管理，每天早、晚各噴水1次，高溫時(shí)不噴水。子實(shí)體原基形成后，及時(shí)進(jìn)行疏蕾，每袋保留生長(zhǎng)力較強(qiáng)的1個(gè)原基。

子實(shí)體分化期要保持空氣濕度在80%～85%，加強(qiáng)通風(fēng)管理。靈芝菌蓋邊緣的白色消失，開始套筒收集孢子粉，孢子粉收集結(jié)束的依據(jù)是菌蓋背面顏色變深，則收集孢子粉結(jié)束，記錄采收時(shí)長(zhǎng)并取下套筒，將孢子粉統(tǒng)一回收至干凈的器具內(nèi)。同時(shí)觀察記錄各菌株農(nóng)藝性狀、高溫爛棒率，并記錄各個(gè)菌株孢子粉及子實(shí)體產(chǎn)量。選取孢子粉產(chǎn)量較高的菌株，進(jìn)行孢子粉中靈芝多糖和三萜含量的測(cè)定，做好數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 靈芝三萜和多糖含量的測(cè)定

靈芝孢子粉用乙醇加熱回流并超聲破壁，采用齊墩果酸作為對(duì)照品，經(jīng)香草醛-高氯酸溶液顯色后做全波長(zhǎng)測(cè)定，以此計(jì)算樣品中三萜含量。具體試驗(yàn)步驟如下。

精密稱取烘干的樣品0.5 g，用95%的乙醇浸泡所有樣品并定容至50 mL，超聲提取2 h，期間經(jīng)常搖動(dòng)，于離心機(jī)中4 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL 于各 10 mL 具塞試管中，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.5 mL，混勻后加塞，置60℃水浴恒溫加熱20 min，取出后迅速冷卻，再加入5 mL的冰醋酸，混勻后于550 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取樣品溶液1.0 mL置于試管中，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸1.2 mL后，按照齊墩果酸對(duì)照品溶液處理方法處理，于550 nm處測(cè)定吸光度值。靈芝三萜含量（W，%）的計(jì)算公式如下：

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品分解的三萜含量（μg）；v1為樣品定容體積（mL）；m為樣品的質(zhì)量（g）；v2為比色測(cè)定時(shí)所移取試樣分解液的體積 （mL）。

粗多糖采用SN/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定[8]中的方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用ANOVA單因子方差分析，P＜0.05作為評(píng)判顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長(zhǎng)速度和農(nóng)藝性狀

8個(gè)供試菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)和農(nóng)藝性狀見表1。

表1 8個(gè)靈芝菌株生長(zhǎng)情況Tab.1 Growth situation of eight strains of Ganoderma lingzhi

從表1可以看出，8個(gè)靈芝菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均較強(qiáng)，其中日芝和韓芝菌絲長(zhǎng)勢(shì)比其他幾個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)稍弱，其他6個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均強(qiáng)。

8個(gè)菌株菌絲體形態(tài)特征均呈現(xiàn)出菌絲潔白、濃密，生長(zhǎng)較快。比較菌絲滿袋天數(shù)發(fā)現(xiàn)，美芝的菌絲生長(zhǎng)速度最快，50 d長(zhǎng)滿菌袋，其次為滬農(nóng)1號(hào)、113、X16、角芝、泰山，60 d長(zhǎng)滿菌袋，日芝、韓芝菌絲生長(zhǎng)速度最慢，65 d長(zhǎng)滿菌袋。8個(gè)菌株接種成活率較高，均為99%以上。8個(gè)供試菌株中日芝和泰山覆土栽培后高溫爛棒率較高，分別為15%和10%；韓芝、美芝爛棒率最低為2%；其余菌株（角芝、113、X16、滬農(nóng)1號(hào)） 高溫爛棒率為5%。8個(gè)菌株現(xiàn)蕾時(shí)間不一，美芝排場(chǎng)后現(xiàn)蕾最快，9 d開始現(xiàn)蕾；滬農(nóng)1號(hào)和X16需12 d現(xiàn)蕾；角芝13 d現(xiàn)蕾；泰山15 d現(xiàn)蕾，日芝、韓芝和113需17 d現(xiàn)蕾。排場(chǎng)后待菌蓋邊緣黃色褪去，即套筒準(zhǔn)備采收靈芝孢子粉，美芝開始產(chǎn)粉所需時(shí)間最短，排場(chǎng)后30 d即開始產(chǎn)粉；角芝排場(chǎng)后37 d開始產(chǎn)粉；韓芝排場(chǎng)后43 d開始產(chǎn)粉；泰山排場(chǎng)后47 d開始產(chǎn)粉；113排場(chǎng)后48 d開始產(chǎn)粉；X16和日芝排場(chǎng)后49 d開始產(chǎn)粉；滬農(nóng)1號(hào)開始產(chǎn)粉所需時(shí)間最長(zhǎng)，排場(chǎng)后51 d開始產(chǎn)粉。韓芝采收時(shí)長(zhǎng)最長(zhǎng)，從開始采收到采收結(jié)束需40 d，113菌株采收孢子粉33 d，其余6個(gè)育粉菌株采收孢子粉均需30 d。

8個(gè)靈芝菌株子實(shí)體的菌蓋直徑與菌柄長(zhǎng)度記錄見表2。

表2 8個(gè)靈芝菌株子實(shí)體農(nóng)藝性狀Tab.2 Agronomic characters of fruit bodies of eight strains of Ganoderma lingzhi

從表2中可知，8個(gè)供試菌株菌蓋直徑從大到小依次為：美芝＞韓芝＞X16＞角芝≈滬農(nóng)1號(hào)＞泰山＞113≈日芝；8個(gè)菌株菌蓋直徑差異均不顯著，菌蓋直徑為11.54 cm～13.53 cm，美芝菌蓋直徑最大，113、日芝菌蓋直徑最小。8個(gè)供試菌株中菌柄長(zhǎng)度依次為：滬農(nóng)1號(hào)＞113＞X16＞角芝＞日芝＞韓芝＞泰山＞美芝；其中滬農(nóng)1號(hào)菌柄長(zhǎng)度最長(zhǎng)，與113、X16菌柄平均長(zhǎng)度差異不顯著，與角芝、日芝、韓芝、泰山、美芝差異顯著；美芝菌柄長(zhǎng)度最短，與韓芝、泰山菌柄平均長(zhǎng)度差異不顯著，與滬農(nóng)1號(hào)、113、X16、角芝、日芝差異顯著。記錄子實(shí)體形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，113朵形偏小，滬農(nóng)1號(hào)朵形均勻，日芝朵形欠圓且大小不均，其余菌株朵形均圓整；8個(gè)菌株只有美芝菌蓋顏色正面呈紅褐色，背面呈灰色，其余7個(gè)菌株均菌蓋顏色正面呈褐色，背面呈淡黃色。

2.2 孢子粉和子實(shí)體平均產(chǎn)量

按90袋菌袋的總量計(jì)，8個(gè)供試靈芝菌株的孢子粉和子實(shí)體平均產(chǎn)量見表3。

表3 8個(gè)靈芝菌株孢子粉和子實(shí)體平均產(chǎn)量Tab.3 Average yield of spore powder and fruit body of eight strains of Ganoderma lingzhi

由表3可知，供試的8個(gè)菌株中，孢子粉平均產(chǎn)量從高到低依次是：美芝＞角芝＞滬農(nóng)1號(hào)＞X16＞113＞韓芝＞泰山＞日芝。其中美芝孢子粉平均產(chǎn)量最高，與角芝、滬農(nóng)1號(hào)、X16、113差異不顯著，與韓芝、泰山、日芝差異顯著，日芝孢子粉平均產(chǎn)量最低，與泰山差異不顯著，與其他菌株差異顯著；韓芝與其他7個(gè)菌株孢子粉產(chǎn)量差異均顯著。子實(shí)體平均產(chǎn)量從高到低依次為：韓芝＞日芝＞泰山＞113＞X16＞滬農(nóng)1號(hào)＞角芝＞美芝。其中韓芝子實(shí)體平均產(chǎn)量最高，與美芝子實(shí)體平均產(chǎn)量差異顯著，與其他6個(gè)菌株子實(shí)體平均產(chǎn)量差異不顯著；美芝子實(shí)體平均產(chǎn)量最低，與其他7個(gè)菌株子實(shí)體平均產(chǎn)量均差異顯著。

2.3 三萜和多糖含量

對(duì)8個(gè)靈芝菌株的孢子粉三萜含量和多糖含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表4 8個(gè)靈芝菌株孢子粉活性成分Tab.4 Active ingredient in spore powder of Ganoderma lingzhi

從表4可知，孢子粉中三萜含量由高到低依次為：滬農(nóng)1號(hào)＞113≈美芝＞X16＞韓芝＞泰山＞角芝≈日芝。其中滬農(nóng)1號(hào)孢子粉中三萜含量最高，與113、美芝、X16、韓芝差異不顯著，與泰山、角芝日芝差異顯著；角芝和日芝孢子粉中三萜含量最低，角芝與日芝、X16、韓芝和泰山間差異不顯著，與滬農(nóng)1號(hào)、美芝差異顯著；日芝與X16、韓芝、泰山、角芝差異不顯著，與滬農(nóng)1號(hào)、113和美芝差異顯著。孢子粉中多糖含量從高到低依次為：113＞滬農(nóng)1號(hào)＞美芝＞韓芝＞X16＞角芝≈日芝＞泰山。其中113孢子粉多糖含量最高，與其他7個(gè)菌株孢子粉中多糖含量差異顯著；其次是滬農(nóng)1號(hào)，與美芝、韓芝、X16孢子粉中多糖含量差異不顯著，與角芝、日芝、泰山、113差異顯著；泰山孢子粉中多糖含量最低，與X16、角芝、日芝差異不顯著，與113、滬農(nóng)1號(hào)、美芝、韓芝差異顯著。

3 討論

目前科研工作者主要是用農(nóng)藝性狀或采用分子標(biāo)記法和同工酶的方法來(lái)篩選和評(píng)價(jià)菌株[9-10]，而分子標(biāo)記和同工酶的分子化學(xué)方法比較費(fèi)時(shí)[11]。因此試驗(yàn)觀察了8個(gè)靈芝菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)及菌絲體形態(tài)特征，量化了多個(gè)靈芝菌株的農(nóng)藝性狀，對(duì)其孢子粉和子實(shí)體產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)一步對(duì)孢子粉中的三萜和靈芝多糖進(jìn)行了含量測(cè)定。從試驗(yàn)結(jié)果中可以總結(jié)出美芝的菌絲生長(zhǎng)速度最快、高溫爛棒率低、現(xiàn)蕾及產(chǎn)粉時(shí)間短，從下田排場(chǎng)到孢子粉采收結(jié)束僅需要69 d，比其他育粉靈芝菌株中最快的角芝快11 d，比最慢的韓芝快31 d，美芝作為工廠化育粉靈芝菌株，其生產(chǎn)周期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且孢子粉中三萜和多糖含量均僅次于滬農(nóng)1號(hào)和113。角芝菌絲生長(zhǎng)速度、高溫爛棒率以及從現(xiàn)蕾到孢子粉采收結(jié)束時(shí)間僅次于美芝，比美芝慢11 d，孢子粉產(chǎn)量也僅次于美芝。

從各菌株的子實(shí)體產(chǎn)量結(jié)果分析中可以看出，孢子粉產(chǎn)量低的菌株子實(shí)體產(chǎn)量均較高，相反孢子粉產(chǎn)量高的角芝、美芝子實(shí)體產(chǎn)量均較低，輔助證明這2個(gè)菌株的生物轉(zhuǎn)化率較高。因此，美芝和角芝均符合工廠化生產(chǎn)對(duì)菌株生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)的條件要求。滬農(nóng)1號(hào)和菌株113，雖然從現(xiàn)蕾到孢子粉采收時(shí)間均在90 d以上，但滬農(nóng)1號(hào)孢子粉中三萜含量最高，除與美芝的孢子粉三萜含量差異不顯著外，與其余菌株均有顯著差異，113孢子粉中多糖含量最高，且與其他菌株的差異均顯著，因此滬農(nóng)1號(hào)和菌株113也可作為工廠化育粉靈芝栽培備選菌株。

工廠化靈芝栽培，具有不與人爭(zhēng)糧、不與糧爭(zhēng)地、不與地爭(zhēng)肥、不與農(nóng)爭(zhēng)時(shí)、不與其他行業(yè)爭(zhēng)資源的優(yōu)勢(shì)，且栽培環(huán)境清潔，全程采用標(biāo)準(zhǔn)化管理，數(shù)字化操作，可避免孢子粉及子實(shí)體中農(nóng)藥殘留及重金屬污染，提高靈芝生產(chǎn)質(zhì)量安全，實(shí)現(xiàn)靈芝標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。工廠化靈芝栽培除可彌補(bǔ)棚式代料栽培的不足之外，選用雜木屑作為培養(yǎng)料，可減少森林資源的過(guò)度消耗，維持生態(tài)環(huán)境健康可持續(xù)發(fā)展。

通過(guò)農(nóng)藝性狀結(jié)合孢子粉和子實(shí)體產(chǎn)量以及孢子粉中的主要活性成分的分析，為靈芝工廠化栽培篩選出較適合菌株，為未來(lái)的靈芝產(chǎn)業(yè)向工廠化、現(xiàn)代化、高標(biāo)準(zhǔn)、高品質(zhì)、健康綠色發(fā)展提供優(yōu)良菌株。但對(duì)篩選出的育粉靈芝優(yōu)勢(shì)菌株，在工廠化更精準(zhǔn)的控溫養(yǎng)菌、控溫出芝等條件下農(nóng)藝性狀以及孢子粉中三萜和靈芝多糖含量是否會(huì)有進(jìn)一步提升，還需探索研究。