苗彩霞，史明澤，尹曉約，宋文浩，王一東

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

鐘菌（Verpa spp.）屬于真菌門（Mycophyta）子囊菌亞門 （Ascomycotina） 盤菌綱 （Discomycetes）盤菌目（Pezozales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 鐘菌屬（Verpa），屬內(nèi)有多個(gè)亞種，因其子實(shí)體橫斷面與鐘罩相似而得名。其肉質(zhì)脆、味鮮美，親緣關(guān)系上與羊肚菌屬（Morchella） 密切，外型也與羊肚菌類似，因此又被稱為假羊肚菌或小羊肚菌。目前國內(nèi)有云南、西藏、山西、吉林等地分布的報(bào)道[1-6]。

隨著生活水平的提高，人們對(duì)營養(yǎng)、美味、健康食材的需求越來越大，而珍稀美味的食用菌越來越受到人們的青睞。食用菌的滋味和口感與其所含的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成有很大關(guān)系，包括可溶性糖醇﹑呈味氨基酸、風(fēng)味核苷酸、有機(jī)酸、呈味肽以及其他類呈味物質(zhì)，其中以谷氨酸為代表的L構(gòu)型天然氨基酸是食品中具有鮮香味道的主要貢獻(xiàn)組分，呈味氨基酸的類型與含量是影響風(fēng)味的主要因素之一[7-8]。目前氨基酸的分析方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法等[7，9-15]。雖然鐘菌是與以美味著稱的羊肚菌親緣關(guān)系很近的食用菌，但目前對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)的組成了解較少。研究利用柱前衍生高效液相色譜法對(duì)鐘菌樣本的風(fēng)味類氨基酸組成及含量進(jìn)行了初步的檢測，并與羊肚菌進(jìn)行了比較，為認(rèn)識(shí)了解和開發(fā)利用鐘菌提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

鐘菌子實(shí)體樣本，2016年5月采集于長春市凈月潭國家森林公園，經(jīng)孢子萌發(fā)、菌絲培養(yǎng)、測序及形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定其為皺蓋鐘菌 [Verpa bohemica（Krombh.）J.Schr?t.]，同時(shí)鑒定保存的還有普通羊肚菌樣本[Morchella esculenta（L.）Pers.]。自然干燥后子實(shí)體樣本保存于長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

甲醇、乙腈均為色譜純?cè)噭徲诿绹惸w世爾公司；18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國惠世生化試劑有限公司（上海）；異硫氰酸苯酯、甲酸、鹽酸等其他試劑，均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器與設(shè)備

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀，德國安捷倫科技有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱取干燥后的鐘菌子實(shí)體樣本（菌蓋、菌柄混合）200.0 mg，充分研磨后溶于4.0 mL的30%甲醇和0.1%甲酸水溶液，45℃超聲破碎儀超聲30 min破碎再混勻，12 000 r·min-110℃離心10 min，取上清液0.22 μm濾膜過濾，即得50.0 mg·mL-1的樣品提取液，此提取液為鐘菌待檢樣品。4℃保存待用[16]。

同樣的方法處理得到羊肚菌待檢樣品。

1.2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精準(zhǔn)稱取天門冬氨酸（Asp） 1.43 mg、蘇氨酸（Thr） 0.76 mg、 絲氨酸 （ser） 0.76 mg、 谷氨酸（Glu） 3.11 mg、甘氨酸 （Gly） 0.41 mg、丙氨酸（Ala）1.12 mg、纈氨酸（Val）0.81 mg、半胱氨酸（Cys）0.17 mg、蛋氨酸（Met）0.16 mg、異亮氨酸（Ile） 0.69 mg、亮氨酸 （Leu） 0.60 mg、酪氨酸（Tyr）0.41 mg、苯丙氨酸（Phe）0.61 mg、賴氨酸（Lys） 0.31 mg、組氨酸 （His） 0.21 mg、精氨酸（Arg） 0.67 mg、脯氨酸 （Pro） 0.56 mg、色氨酸（Trp） 0.15 mg，分別放入100 mL容量瓶中，各加入100 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸定容，此為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。4℃保存待用。

1.2.3 色譜條件

參考黃元河[12]、王敏[13]的方法，采用InertSustain-C18色譜柱 （250 mm×1.6 mm，5 μm），進(jìn)樣體積為 20 μL；流速為 0.80 mL·min-1；柱溫 40℃。

以 0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液-乙腈 （93∶7，pH 6.5） 為流動(dòng)相 A，甲醇-乙腈-水 （1∶3∶1） 為流動(dòng)相B，參照洗脫梯度見表1[12]，為求得最優(yōu)的樣本分離效果，進(jìn)行隨時(shí)間改變的A/B相濃度梯度洗脫條件比較。

表1 流動(dòng)相洗脫程序Tab.1 Mobile phase elution procedure

1.2.4 衍生化試劑的制備與樣品的衍生化處理

衍生試劑A（1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液）：量取1.4 mL三乙胺于試劑瓶中，加入8.6 mL乙腈，混勻，4℃保存；

衍生試劑B（0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯乙腈溶液）：量取0.12 mL異硫氰酸苯酯于試劑瓶中，加入9.88 mL乙腈，混勻，4℃保存。

參考唐翎等[9，12]試驗(yàn)方法，分別取1.2.1中鐘菌、羊肚菌樣品提取液400 μL，衍生試劑A、衍生試劑B各200 μL于2.5 mL離心管中避光，反應(yīng)1 h后加入 800 μL 正己烷振蕩 5 min，12 000 r·min-1，10℃離心5 min，取下層液約0.5 mL用0.22 μm濾膜過濾，即得衍生樣液。選擇異硫氰酸苯酯柱前衍生法[9]與樣品無衍生處理進(jìn)行分離效果比較。

各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及空白樣品（30%甲醇和0.1%甲酸水溶液）衍生化處理同上。

1.2.5 數(shù)據(jù)收集與分析

樣品重復(fù)檢測3次，數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件完成。氨基酸味道強(qiáng)度值（Taste active value，TAV）的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[7，17-18]。 味道強(qiáng)度值（TAV） 是用來評(píng)價(jià)樣品中某一呈味成分（本研究中為氨基酸）對(duì)樣品鮮味強(qiáng)度的影響程度的數(shù)值。計(jì)算公式為：

式中：C為樣品中所含該種氨基酸濃度（mg·g-1）；T為該種氨基酸的味覺閾值。

當(dāng)TAV>1時(shí)，該種呈味物質(zhì)對(duì)于樣品的呈味有顯著影響，數(shù)值越大則貢獻(xiàn)越大；當(dāng)TAV<1時(shí)，表明該呈味物質(zhì)對(duì)呈味貢獻(xiàn)不大，呈味作用不顯著[7，18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件流動(dòng)相的影響

參照的流動(dòng)相分離鐘菌樣品在4 min～15 min出鋒，分離效果不理想。在此基礎(chǔ)上嘗試了2種洗脫梯度，甲法：

圖1 洗脫梯度甲（A）、洗脫梯度乙（B）、空白對(duì)照（C） 液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of elution gradient(A),elution gradient(B)and blank control(C)

4 min～11 min，95%～80%流動(dòng)相A，5%～20%流動(dòng)相B；乙法：0～11 min，100%～95%流動(dòng)相A，0～5%流動(dòng)相B。得到的分離效果見圖1。

圖1所示，流動(dòng)相梯度乙方法較甲方法出鋒狀況有所改善，分離效果優(yōu)于甲方法，因此采用乙方法進(jìn)行流動(dòng)相梯度洗脫。

2.2 柱前衍生的效果

皺蓋鐘菌衍生效果變化情況見圖2。

圖2 皺蓋鐘菌衍生前（A）、鐘菌衍生后（B） 液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatograms of Verpa bohemica before(A)and after(B)derivatization

由圖2所示，樣品提取液直接加樣得到的色譜圖峰（A），約4 min時(shí)色譜峰集中，且在10 min、29 min、35 min處色譜峰識(shí)別效果較差；選擇異硫氰酸苯酯柱前衍生法處理樣品，得到的樣本氨基酸較之前具有良好的出峰分離和識(shí)別效果（B）。

2.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果

采用上述流動(dòng)相洗脫梯度乙方法及樣品柱前衍生方法，對(duì)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，其線性關(guān)系統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 18種氨基酸的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of 18 amino acids

由表2所示，上述氨基酸在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 樣品測定結(jié)果

對(duì)皺蓋鐘菌中的風(fēng)味類氨基酸組成進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)品圖譜峰號(hào)1～18分別為天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸；得到的樣本（A）、標(biāo)準(zhǔn)品（B） 及空白對(duì)照（C，30%甲醇和0.1%甲酸水溶液的衍生化溶液） 液相色譜圖分析結(jié)果見圖3。

圖3 皺蓋鐘菌樣品（A）、18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（B）和空白對(duì)照（C）液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of Verpa bohemica sample(A),18 Amino acids mixed standard(B)and blank control(C)

由圖3可知，在皺蓋鐘菌中共檢測到18種氨基酸，其中呈味氨基酸有15種，包括天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等。

采用與鐘菌相同的處理方法對(duì)羊肚菌中風(fēng)味類氨基酸進(jìn)行檢測，二者色譜圖的對(duì)比情況見圖4。

圖4 羊肚菌（A）、皺蓋鐘菌（B） 液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatograms of Morchella esculenta(A)and Verpa bohemica(B)

由圖4可知，羊肚菌（A） 與皺蓋鐘菌（B） 有著近似的圖譜，說明其含有相同的氨基酸種類；圖譜中峰高有區(qū)別，說明部分氨基酸的含量（濃度）不同，呈味氨基酸含量（濃度）的不同使得二者的風(fēng)味有區(qū)別。

結(jié)合表2線性方程得到鐘菌、羊肚菌樣品氨基酸含量值，根據(jù)TAV計(jì)算公式計(jì)算得對(duì)應(yīng)的呈味氨基酸TAV，結(jié)果見表3。

表3 皺蓋鐘菌和羊肚菌呈味氨基酸組成及TAVTab.3 Amino acid composition and teste active value of Verpa bohemica and Morchella esculenta

由表3可知，羊肚菌中TAV>1的有：天門冬氨酸（5.440）、谷氨酸（4.550）、甘氨酸（2.012）、組氨酸（4.420）、精氨酸（4.040）、蘇氨酸 （1.019）、甲硫氨酸（1.053），對(duì)鮮、酸、甜、苦味均有較大貢獻(xiàn)，羊肚菌鮮美的味道與這些氨基酸的重要貢獻(xiàn)有關(guān)；皺蓋鐘菌TAV>1的有：天門冬氨酸（5.178）、谷氨酸（4.397）、甘氨酸（1.223）、組氨酸（6.230）、精氨酸（6.328）、蘇氨酸（1.022）、纈氨酸（1.065）、甲硫氨酸（13.910），對(duì)鮮、酸、甜、苦味亦均有較大貢獻(xiàn)。且皺蓋鐘菌與羊肚菌對(duì)應(yīng)的氨基酸TAV接近，說明其具有與羊肚菌的味道鮮美的相似氨基酸組成。對(duì)于呈味氨基酸總量和必需氨基酸含量，皺蓋鐘菌均多于羊肚菌。

3 討論

從檢測結(jié)果可以看出，野生皺蓋鐘菌子實(shí)體中含有天門冬氨酸、谷氨酸等15種風(fēng)味類氨基酸，其中氨基酸TAV大于味覺閾值的有天門冬氨酸、谷氨酸等8種氨基酸，對(duì)鮮、酸、甜、苦味均有較大貢獻(xiàn)，構(gòu)成了鐘菌獨(dú)特的風(fēng)味。

對(duì)比羊肚菌的檢測結(jié)果可以看出，野生皺蓋鐘菌子實(shí)體中風(fēng)味類氨基酸種類與羊肚菌相似，都含有組氨酸、精氨酸等15種風(fēng)味類氨基酸，但二者風(fēng)味類氨基酸含量對(duì)呈味的貢獻(xiàn)有差異，且皺蓋鐘菌的呈味氨基酸總量大于羊肚菌，這也驗(yàn)證了民間小羊肚菌（鐘菌）比羊肚菌味道鮮美的說法。從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，皺蓋鐘菌與羊肚菌均含有人體必需的8種氨基酸，且皺蓋鐘菌的必需氨基酸含量大于羊肚菌。說明檢測樣本野生鐘菌風(fēng)味與營養(yǎng)價(jià)值不遜于野生羊肚菌。

目前羊肚菌的栽培面積在逐年擴(kuò)大，但人們對(duì)羊肚菌的生活史還未完全了解，羊肚菌的人工栽培還存在著較大的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。鐘菌和羊肚菌的親緣關(guān)系很近，可否可通過對(duì)鐘菌的深入了解，尤其是對(duì)其生活史的研究，為人們認(rèn)識(shí)羊肚菌的生活史提供參考和幫助。此外，研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌有多種保健作用，如抗疲勞功能等[19-20]，鐘菌作為羊肚菌的近親，對(duì)其開展包括風(fēng)味物質(zhì)在內(nèi)的食（藥）用價(jià)值、功能活性等的深入研究，可為開發(fā)利用這一珍稀食用菌資源提供幫助。研究僅對(duì)皺蓋鐘菌與普通羊肚菌進(jìn)行了比較試驗(yàn)，其他種類鐘菌的風(fēng)味氨基酸檢測分析還有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。