張 鶴 趙慧霞 曾志艷 李慶艷 云 超 關(guān) 娜 李秋文 肖文華

解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心腫瘤內(nèi)科，北京 100048

肝細(xì)胞肝癌是我國常見惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命。當(dāng)前抗血管生成聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune-check point inhibitor，ICI）的治療使晚期肝癌患者的平均生存時間超過1 年[1]，但仍有提升的空間。ICI 的治療目的主要是釋放細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）的殺瘤能力；產(chǎn)生CTL 必須具有的特異性腫瘤抗原，尤其是腫瘤新抗原（tumour neoantigen，TNA）[2]。當(dāng)前TNA 定義是腫瘤基因編碼區(qū)非同義突變產(chǎn)生的新的癌蛋白[2]；然而，該定義并不全面，忽略了另一大類受表觀遺傳調(diào)控的、與TNA 同樣具有腫瘤特異性和強(qiáng)大免疫原性的新抗原腫瘤-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）。CTAs 是一大類只在睪丸和腫瘤中表達(dá)的免疫原性較強(qiáng)的腫瘤相對特異抗原，因高甲基化而沉默。由于腫瘤的廣泛低甲基化，導(dǎo)致位于X 染色體的CTAs 基因不同程度去甲基化，部分沉默的CTAs 重新開放表達(dá)并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[3]。但是，由于CTAs 表達(dá)水平受其去甲基化程度的影響，同一腫瘤不同個體，甚至同一腫瘤不同亞克隆瘤細(xì)胞的CTAs 表達(dá)存在明顯的異質(zhì)性。長期的低濃度CTAs 慢性刺激將導(dǎo)致CTL 失能或衰竭，或CTAs 被再甲基化而再次沉默從而影響免疫治療效果或產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥[3-4]。因此，新生CTAs（novel cancer-testis antigens，nCTAs）的產(chǎn)生是提高免疫治療或逆轉(zhuǎn)免疫耐藥的重要措施之一。5-脫氧雜氮胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-CdR）是DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能使CTAs去甲基化并重新和持續(xù)表達(dá)[5]，但由于該藥存在細(xì)胞毒性，限制了臨床廣泛應(yīng)用。本文目的是探討小劑量的5-aza-CdR 能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)nCTAs，為未來制訂肝癌的免疫治療及免疫耐藥的再挑戰(zhàn)提供對策。

1 材料與方法

1.1 肝癌細(xì)胞株和主要試劑

肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721 和BEL-7402 購自中國細(xì)胞收藏中心，MHCC97L 和MHCC97M3 購自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所；胎牛血清（北京中科康源生物科技公司，貨號：#13011-611）；兔抗人CT10抗體（英國Abcam 公司，貨號ab209667）；鼠抗人-tubulin 抗體和羊抗兔二抗（美國Sigma 公司，貨號分別為#T9026 和#12-349）；5-aza-CdR（美國Sigma 公司，貨號：#2353-33-5）；Trizol RNA 提取試劑盒（美國Qiagen 公司，貨號：#97306）；Oligo（dT）、RT-PCR 試劑盒、Moloney 小鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（美國Promega 公司，貨號分別為：#M1701 和#A1260）；DNA Marker、Taq 酶（德國Qiagen 公司，貨號分別為#929560和#201203）；蛋白濃度Bio-Rad 測定試劑盒（美國Bio-Rad 公司，貨號：#5000002EDU）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402，MHCC97L 和MHCC97M3 在含10%胎牛血清和各100 U/ml 的青、鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.3 藥物處理

將處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞株HepG2 按每組接種1×104個細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每組重復(fù)3 次，24 h 后換新鮮配制的分別含5-aza-CdR 0、0.5、1.0、1.5 μmol/L 的培養(yǎng)液于四組培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3 d，每24 h 更換培養(yǎng)液，0 mmol/L 處理的細(xì)胞作為對照組，0.5 μmol/L 為實(shí)驗1 組，1.0 μmol/L 為實(shí)驗2 組，1.5 μmol/L為實(shí)驗3 組。5-aza-CdR 藥物濃度的選擇是參照以前的實(shí)驗研究和文獻(xiàn)[5]而選定的。

1.4 RT-PCR 技術(shù)檢測CTAs mRNA 表達(dá)

用Trizol 試劑（Gibco BRL）提取總RNA；參照試劑盒說明書用oligo-dT 引物和Moloney 小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT 反應(yīng)體系包括總RNA 2 μg，oligo-dT 0.5 μg，10×緩沖液2 μl，dNTP 1 mmol/L，RNasin 20 U，Moloney 小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，去離子水，總反應(yīng)體積20 μl；然后采用PCR 擴(kuò)增cDNA，所用PCR 擴(kuò)增儀為Smart Cycler（Biotech，Beijing）；PCR 反應(yīng)體系總體積30 μl，其中含去離子水22.5 μl，10×緩沖液3 μl，上下引物各1 μl（500 pmol/L），dNTP 1 μl（200 μmol/L），Taq 酶0.5 μl（1 U），相應(yīng)cDNA 1 μl；擴(kuò)增參數(shù)為：先95℃變性5 min，然后95℃20 s，退火45 s（退火溫度見表1），72℃延伸30 s，共循環(huán)36 次，最后72℃孵育10 min；將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB 染色、照相。所用引物見表1。

表1 PCR 擴(kuò)增各種CTAs 引物序列

1.5 Western blot 檢測HepG2 細(xì)胞CT10 蛋白表達(dá)

由于SSX 抗原有9 個成員，其氨基酸序列同源性高達(dá)87%～96%，到目前為止尚無針對任一SSX 成員的特異性抗體，不能進(jìn)行單個SSX 的蛋白印跡。收集培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的HepG2 肝癌細(xì)胞于含蛋白酶抑制劑的緩沖液中裂解，蛋白濃度采用Bio-Rad 測定試劑盒測定。取50 μg 蛋白于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離過夜，并將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯復(fù)合分離膜（美國Bio-Rad，貨號：1620177），在4℃下，用5%去脂乳液封閉非特異成分，用封閉液稀釋一抗CT10，稀釋度為1∶100，在Tris-緩沖液中與抗CT10 抗體進(jìn)行雜交過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋度為1∶2 500）室溫孵育1 h，洗膜、ECL 法發(fā)光、X 線曝光、照相。采用SSX1 和CT10 表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin 表達(dá)量的灰度比值作為兩種CTAs 的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。并采用SNK-q 法進(jìn)行均數(shù)多重比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞株CTAs 的差異表達(dá)

在SMMC-7721、BEL-7402、MHCC97L、MHCC97M3和HepG2 肝癌細(xì)胞株中，MAGE1、MAGE3、CT10、CTp11、NY-ESO-1 和SSX1 存在差異表達(dá)，其中HepG2 表達(dá)MAGE1、MAGE3、CTp11 和NY-NSO-1，MHCC97L 和MHCC97M3表達(dá)MAGE1、MAGE3、CT10、CTp11和SSX1，BEL-7402 表達(dá)MAGE1、MAGE3 和CTp11，而SMMC-7721 只表達(dá)MAGE1、MAGE3，見圖1。在HepG2 肝癌細(xì)胞株中，MAGE1、MAGE3、CTp11 和NY-ESO-1 表達(dá)，但CT10 和SSX1 不表達(dá)；選擇HepG2 肝癌細(xì)胞株作為下一步研究的細(xì)胞模型。

圖1 5 株肝癌細(xì)胞CTAs 的差異表達(dá)（n＝3）

2.2 5-aza-CdR 可誘導(dǎo)新的CT10 和SSX1 的表達(dá)

2.2.1 小劑量5-aza-CdR 誘導(dǎo)新抗原CT10 和SSX1 mRNA 表達(dá)RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)對照組無新生CTA SSX1 和CT10 表達(dá)，實(shí)驗1、2 和3 組均可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞SSX1 和CT10 新生抗原不同程度表達(dá)。在SSX1 表達(dá)上，實(shí)驗3 組mRNA 表達(dá)高于實(shí)驗1、2 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗2 組表達(dá)高于實(shí)驗1 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在CT10 表達(dá)上，實(shí)驗3 組表達(dá)高于實(shí)驗1 組和2 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗1 組和2 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度5-aza-CdR 誘導(dǎo)HepG2 肝癌細(xì)胞株新生SSX1和CT10 mRNA 表達(dá)（n＝3）

2.2.2 小劑量5-aza-CdR 誘導(dǎo)新抗原CT10 蛋白的表達(dá)Western blot 顯示對照組無CT10 蛋白表達(dá)，實(shí)驗1、2 和3 組均可誘導(dǎo)CT10 蛋白表達(dá)，實(shí)驗3 組相對表達(dá)量最高，與實(shí)驗1 組和2 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗1 組和2 組相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度5-aza-CdR 誘導(dǎo)HepG2 肝癌細(xì)胞株新生CT10 蛋白表達(dá)水平比較（n＝3）

3 討論

狹義的NTA 一般被認(rèn)為是腫瘤癌基因編碼區(qū)發(fā)生導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變的非同義突變，這些癌蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，容易被機(jī)體識別為外來抗原并產(chǎn)生特異的CTL，NTA 是ICI 治療效果的另一重要的指標(biāo)[6]。總之，NTA 需具備兩個基本條件：①機(jī)體免疫系統(tǒng)從未接觸過只在癌細(xì)胞中表達(dá)的癌蛋白，即抗原表達(dá)的腫瘤特異性；②癌蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，即該抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生CTL 細(xì)胞。那么CTAs 蛋白是機(jī)體成熟免疫系統(tǒng)從來未接觸的腫瘤相對特異、只在腫瘤和睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá)，后者由于缺乏MHC Ⅰ分子，不能激發(fā)起相關(guān)免疫反應(yīng)，即CTAs 的腫瘤特異性；同時，CTAs 具有較強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，在既往腫瘤疫苗、CTL 和CAR-T制備及聯(lián)合免疫治療中都顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤作用[7]，符合腫瘤新生抗原的兩大基本特點(diǎn)。因此，認(rèn)為CTAs 盡管沒有發(fā)生基因突變和蛋白質(zhì)氨基酸改變，而是通過表觀遺傳修飾的變化產(chǎn)生的新抗原，本研究首次提出nCTAs 是廣義的腫瘤新生抗原。ICI 阻斷PD-1/PD-L1 免疫負(fù)性調(diào)節(jié)，解除其對已經(jīng)存在腫瘤微環(huán)境中的CTL 的禁錮，釋放其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，是目前逆轉(zhuǎn)免疫耐藥的重要手段[8]，但對嚴(yán)重T 細(xì)胞功能衰竭和CTL 數(shù)量衰減的免疫功能恢復(fù)較困難[9]，亟須更多新生的腫瘤抗原豐富T 細(xì)胞受體多樣性，刺激產(chǎn)生更多的、新的CTL 克隆來對付抗原已經(jīng)變異的腫瘤細(xì)胞，是恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。

除了因腫瘤基因突變產(chǎn)生的新抗原外，以5-aza-CdR 為代表的表觀遺傳藥物可以催生腫瘤細(xì)胞新生CTAs 表達(dá)，即新出現(xiàn)的具有強(qiáng)免疫原性nCTAs，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生新的CTL 克隆。5-aza-CdR 為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，除抑制其酶活性外，還可降低其轉(zhuǎn)錄水平[10]，使CTAs 基因5’端啟動子CpG 島去甲基化而促進(jìn)基因的表達(dá)[7,11]。除此之外，體外較大劑量5-aza-CdR可誘導(dǎo)DNA 的快速損傷和嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，甚至使正常細(xì)胞發(fā)生基因表達(dá)異常[12]；因此，目前的5-aza-CdR 表觀遺傳治療腫瘤目的是把因高甲基化失活的抑癌基因或CTAs 甲基化水平降低到能再次表達(dá)，盡量減少5-aza-CdR 劑量而去除因較高劑量所致的細(xì)胞毒性，即非細(xì)胞毒性的表觀遺傳治療[13-14]。Karahoca 等[15]總結(jié)了5-aza-CdR 在體內(nèi)外使用的劑量和時間，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤類型來源的細(xì)胞株對5-aza-CdR的敏感性不一樣，其敏感性除了與藥物濃度有關(guān)外，還與藥物作用時間長短相關(guān)；即使同為結(jié)腸癌來源的細(xì)胞株之間對5-aza-CdR 的敏感性也不一樣[15]。Tsai等[13]發(fā)現(xiàn)100 nM 5-aza-CdR 短暫處理癌細(xì)胞，就可以使乳腺癌細(xì)胞株、肺癌細(xì)胞株和結(jié)腸癌細(xì)胞株基因組廣泛低甲基化，受高甲基化失活的抑癌相關(guān)基因去甲基化并重新表達(dá)、癌細(xì)胞生長受阻、凋亡增加，相關(guān)重要的細(xì)胞生長信號通路受到抑制；在肝癌細(xì)胞株的研究中，絕大多數(shù)5-aza-CdR 的濃度均在1～100 μmol/L之間[16-18]。在前期基礎(chǔ)研究中，還發(fā)現(xiàn)小劑量5-aza-CdR 只誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞CTAs 表達(dá)，而不誘導(dǎo)正常上皮細(xì)胞CTAs 的表達(dá)，其機(jī)制可能與癌變的細(xì)胞CTAs本身存在不同程度的低甲基化狀態(tài)，小劑量的5-aza-CdR 就可使CTAs 能表達(dá)的去甲基化程度[19]；在一項5-aza-CdR 治療肝轉(zhuǎn)移性腫瘤的Ⅰ期臨床研究中發(fā)現(xiàn)：肝動脈灌注5-aza-CdR 可使30 個CTAs 中的21 個表達(dá)上調(diào)[20]；此外，5-aza-CdR 已經(jīng)批準(zhǔn)用于骨髓異常增生綜合征的適應(yīng)證，臨床發(fā)現(xiàn)常規(guī)劑量5-aza-CdR常常導(dǎo)致嚴(yán)重的骨髓抑制。因此，探索小劑量和超小劑量5-aza-CdR 有實(shí)際臨床意義[21-22]。本研究采用了5 株肝癌細(xì)胞株，采用RT-PCR 技術(shù)分析了MAGE1、MAGE3、CTp11、CT10、NY-ESO-1 和SSX1 等6 種CTAs抗原的mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5 株肝癌細(xì)胞表達(dá)不同的CTAs，呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，提示針對CTAs 的特異免疫治療需先確定腫瘤CTAs 的表達(dá)譜，然后篩選出不表達(dá)CT10 和SSX1 的肝癌細(xì)胞株HepG2 作為本實(shí)驗的細(xì)胞模型，并分別采用3 種低劑量的5-aza-CdR處理HepG2 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 μmol/L 低濃度的5-aza-CdR 就可以誘導(dǎo)本身不表達(dá)CT10 和SSX1 的HepG2 肝癌細(xì)胞表達(dá)，并且呈劑量依賴性，提示CT10和SSX1 為HepG2 肝癌細(xì)胞株的新生抗原；同時小劑量的5-aza-CdR 也減少了藥物的細(xì)胞毒性，增加了藥物的依從性和聯(lián)合其他藥物的機(jī)會；理論上推測這種具有較強(qiáng)的免疫原性的nCTAs 更能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生新的CTL 克??；在聯(lián)合ICI、過繼免疫和其他改善免疫微環(huán)境的治療情況下，大幅度提高免疫治療效果，對免疫耐藥的復(fù)發(fā)和難治性腫瘤的解救治療也發(fā)揮了重要的作用[23-25]。本研究在當(dāng)前惡性腫瘤免疫治療時代，率先提出了小劑量的5-aza-CdR 通過表觀遺傳機(jī)制誘導(dǎo)nCTAs，豐富了TNA 的理論，為表觀遺傳藥物聯(lián)合ICI 免疫治療惡性腫瘤提供了實(shí)驗依據(jù)。