金文剛，趙 萍，金 晶，楊 猛，劉俊霞，耿敬章，陳小華，裴金金，陳德經(jīng)

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001；2.西藏民族大學(xué)法學(xué)院，陜西 咸陽 712082）

大鯢（Andrias davidiauns），俗稱“娃娃魚”，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動物，迄今約有3.5億 年的歷史[1]。大鯢食用和藥用價(jià)值極高，其皮膚、皮膚分泌物、肌肉、骨骼含有很多生物活性物質(zhì)，被譽(yù)為“水中活人參”[2-3]。目前，大鯢人工養(yǎng)殖已在陜西漢中、湖南張家界、河南洛陽、貴州、四川、重慶等地實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化[4-5]，而且養(yǎng)殖大鯢首批進(jìn)入《人工繁育國家重點(diǎn)保護(hù)水生野生動物名錄》，標(biāo)志著國家法律法規(guī)許可養(yǎng)殖大鯢進(jìn)行加工與開發(fā)利用。近年來，研究人員已在大鯢肉營養(yǎng)分析[6-7]、貯藏加工保鮮[8]、硫酸軟骨素[9]、生物活性肽[10-12]、膠原蛋白/明膠[13-15]、油脂提取精煉[16-18]等方面進(jìn)行了一定的應(yīng)用基礎(chǔ)研發(fā)。一些大鯢加工企業(yè)也推出了諸如小包裝大鯢分割肉、膠原蛋白、魚油、日化用品等加工產(chǎn)品。隨著子二代大鯢養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，商品鯢價(jià)格急劇下降，特別是新冠肺炎疫情影響下，出現(xiàn)了商品鯢嚴(yán)重滯銷。大鯢分割及深加工產(chǎn)品開發(fā)日益成為大鯢產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展的重大需求。盡管大鯢營養(yǎng)、滋補(bǔ)和藥用價(jià)值被人們逐漸認(rèn)知，但是養(yǎng)殖大鯢由于飼喂魚餌料造成其腥味較重，限制了部分消費(fèi)群體以及進(jìn)一步加工利用[19]。因此，探究大鯢肉腥味成分物質(zhì)基礎(chǔ)及其脫腥方法，對于大鯢肉深加工及產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。

魚類等水產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)種類多樣，主要包括醛類、醇類、酮類、萜烯衍生物、烴類以及少量呋喃、硫醚、萘類等腥味物質(zhì)，一般是多種揮發(fā)性有機(jī)物協(xié)同作用的結(jié)果[20]。目前，水產(chǎn)品中揮發(fā)性成分分析方法已經(jīng)成熟，氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographmass spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-嗅聞（gas chromatograph-olfactometry，GC-O）、電子鼻、電子舌等，聯(lián)合其他技術(shù)已被廣泛用于水產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性、定量分析[21-24]。氣相-離子遷移譜（gas chromatograph-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是近年來新興揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分離和檢測技術(shù)，與GC-MS技術(shù)相比，該技術(shù)整合了GC-IMS在分離和檢測方面的優(yōu)勢，具有樣品制備簡單、靈敏度高、分辨率高、操作簡便、分析高效和風(fēng)味物質(zhì)可視化等特點(diǎn)，尤其適合食品中揮發(fā)性有機(jī)化合物的痕量分析與檢測[25-26]。

在水產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析方面，陳東杰等[27]采用GC-IMS技術(shù)對靜電場處理和對照組不同貯藏時(shí)間大菱鲆的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，可視化呈現(xiàn)出采用靜電場處理與對照組的大菱鲆在貯藏過程中產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的差異。Chen Kaini等[28]采用GC-IMS技術(shù)分析了鯉魚明膠水解物美拉德反應(yīng)前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；Jia Shiliang等[29]采用GC-IMS技術(shù)對冷藏鯉魚片揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。這些研究為GC-IMS技術(shù)在水產(chǎn)品揮發(fā)性成分分析方面積累了應(yīng)用基礎(chǔ)，并顯示出一定的優(yōu)勢。

水產(chǎn)品不同可食部位由于養(yǎng)殖環(huán)境、飼料、生長周期和化學(xué)成分等因素，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)一般呈現(xiàn)差異性。周若琳等[30]研究發(fā)現(xiàn)草魚不同部位（頭、腹、尾）在常溫和冷凍條件下的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)常溫條件下?lián)]發(fā)性成分以醇類、醛類為主，而冷凍條件下以醇類為主；劉奇等[31]通過頂空固相微萃取-GC-MS從鱘魚腹肉、背肉、尾肉、皮、鰓和肝中共檢出60多種揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)包括醛類、酮類、醇類、烴類和酸類等，其中醛類、醇類、烴類含量較高；鱘魚不同部位揮發(fā)性成分種類和含量不同，醛、烴在鱘魚各部位揮發(fā)性物質(zhì)中占比較大，醇類在肝（32.08%）、皮（44.96%）、鰓（5.51%）含量較高；背肉揮發(fā)性物質(zhì)檢出總量最低。鱘魚的主要特征氣味為青草味、魚腥味及脂類氣味；己醛、1-辛烯-3-醇等是構(gòu)成鱘魚魚腥味的主要成分[31]。

前期研究利用頂空固相微萃取-GC-MS分析了大鯢皮、肉和爪的揮發(fā)性氣味成分，發(fā)現(xiàn)從大鯢的肉、爪、皮中分別鑒定出57、69、49種揮發(fā)性成分，3個部位共有的揮發(fā)性成分為15 種，主要包括醛類、酮類、醇類、酸類、烴類、酯類、胺類，其中壬醛、庚醛呈大鯢的魚腥味，1-辛烯-3-醇、1-辛醇呈大鯢的土腥味[19]。隨著大鯢分割加工的產(chǎn)業(yè)化，商品大鯢按照不同部位小包裝速凍產(chǎn)品已經(jīng)成為熱銷產(chǎn)品形態(tài)之一。然而利用GC-IMS技術(shù)分析大鯢主要可食部位揮發(fā)性氣味物質(zhì)，尚鮮見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究利用新興的GCIMS技術(shù)較全面分析大鯢6個主要可食部位（頭、背、腹、尾、爪和肝）揮發(fā)性成分，并建立揮發(fā)性成分指紋圖譜，以期為今后大鯢分割加工、腥味脫除和品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活大鯢（隨機(jī)選擇3 尾健康無病害子二代個體，體質(zhì)量為（2.74±0.52）kg），于2020年9月購自陜西漢中龍頭山水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)有限公司大鯢養(yǎng)殖基地，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，按照放血、燙殺、刮黏液、去內(nèi)臟后，獲得大鯢胴體。按照企業(yè)現(xiàn)有大鯢肉分割產(chǎn)品，依次取樣為頭、背、腹、尾、爪和肝，共6個部位樣品（圖1），放入自封袋后0～4 ℃保藏，用于揮發(fā)性成分分析。

圖1 大鯢不同可食部位取樣位置Fig. 1 Sampling positions for different edible parts of giant salamander

正酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮（均為分析純） 國藥化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec?風(fēng)味分析儀 德國G.A.S公司；FA320413型電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空進(jìn)樣條件

頂空孵化溫度60 ℃；孵育時(shí)間1 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進(jìn)樣針溫度95 ℃；進(jìn)樣體積800.0 μL，不分流模式；載氣為高純N2（純度≥99.99%）；清洗時(shí)間0.5 min。

1.3.2 GC條件

色譜柱溫度40 ℃；運(yùn)行時(shí)間20 min；載氣為高純N2（純度≥99.99%）；初始流速5.0 mL/min，保持10 min后在5 min內(nèi)線性增至150 mL/min。漂移管長度5 cm；管內(nèi)線性電壓（電場強(qiáng)度）400 V/cm。

1.3.3 IMS條件

MXT-5型色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱溫60 ℃；漂移氣（N2，純度≥99.99%）；流速150 mL/min；IMS溫度45 ℃；分析時(shí)間20 min。

1.3.4 樣品處理及測定

大鯢不同可食部位樣品絞碎后精密稱取3.0 g，放入20.0 mL頂空進(jìn)樣瓶中，60 ℃孵化15 min，頂空進(jìn)樣后用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀直接測試，該儀器通過頂空GC-IMS原理對樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，每個樣品做3個平行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)G.A.S公司開發(fā)的軟件分析獲得樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的差異譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

揮發(fā)性成分分析過程中，調(diào)用儀器LAV（Laboratory Analytical Viewer）和Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA 3個插件分析數(shù)據(jù)，并通過儀器內(nèi)置的GC×IMS Library Search NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢不同可食部位GC-IMS揮發(fā)性氣味成分譜圖

利用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀，對來自大鯢頭部、背部、腹部、尾部、爪部和肝臟共6個不同可食部位揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。圖2是由該儀器自帶LAV分析軟件中的Reporter插件程序獲得的不同部位大鯢肉揮發(fā)性成分3D譜圖?？v坐標(biāo)表示保留時(shí)間，橫坐標(biāo)表示遷移時(shí)間，紅色垂直線表示離子峰，離子峰兩側(cè)的每個點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色的深淺表示含量的高低。一種化合物可能會產(chǎn)生1、2個或多個斑點(diǎn)（代表單體、二聚體或三聚體），具體取決于揮發(fā)性成分含量和性質(zhì)[25-26]。6個不同部位大鯢肉從左到右分別來自頭部、背部、腹部、尾部、爪部和肝臟。從外部觀察可知，6個不同部位大鯢肉的GC-IMS三維譜圖非常近似，難以直觀進(jìn)行揮發(fā)性成分區(qū)分（圖2）。

圖2 大鯢不同可食部位GC-IMS三維譜圖Fig. 2 Three-dimensional GC-IMS spectra of different edible parts of giant salamander

將圖2的三維GC-IMS譜圖投影到二維平面俯視圖見圖3，可直接對大鯢進(jìn)行不同部位揮發(fā)性成分的差異性對比分析。由圖3可以看出，6個不同部位大鯢樣品揮發(fā)性物質(zhì)可通過GC-IMS技術(shù)實(shí)現(xiàn)較好地分離，不同部位大鯢樣品，呈現(xiàn)的GC-IMS特征譜信息有一定差異，且不同部位大鯢樣品中部分揮發(fā)性成分含量出現(xiàn)升高或降低，顯示出較明顯的差異（圖3B中紅色框中所示）。辛茜等[19]利用GC-MS分析表明，大鯢皮、肉和爪的揮發(fā)性成分也呈現(xiàn)一定的差異；通過GC-IMS技術(shù)可對水產(chǎn)品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)快速定性鑒別，而且GC-IMS技術(shù)具有樣品前處理簡單、快速的特點(diǎn)，有關(guān)利用GC-IMS技術(shù)對水產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)分析，進(jìn)一步被其他研究人員所報(bào)道[27-29]。本研究利用GC-IMS技術(shù)分析了大鯢不同可食部位揮發(fā)性成分，結(jié)果表明大鯢不同部位樣品GC-IMS特征譜呈現(xiàn)出一定差異，可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境、飼料、生長周期和化學(xué)成分等因素，造成不同部位樣品揮發(fā)性成分含量的不同[19,31]。

圖3 大鯢不同可食部位GC-IMS二維譜圖Fig. 3 Differential two-dimensional GC-IMS spectra of different edible parts of giant salamander

2.2 大鯢肉GC-IMS揮發(fā)性氣味成分定性分析

通過比較特征性揮發(fā)性成分的保留時(shí)間和遷移時(shí)間，使用外標(biāo)正酮C4～C9作為參考[25,27,29]，計(jì)算每種揮發(fā)性成分的保留指數(shù)，通過GC-IMS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配從而對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析（圖4）。根據(jù)風(fēng)味儀軟件內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫，可以明確定性的揮發(fā)性成分共有34 種（單體及部分物質(zhì)的二聚體），主要包括酯類9種、酮類9種、醛類6 種、醇類7 種、酸類2 種、吡嗪類1 種，其中鑒定的單體、二聚體的化學(xué)式和CAS號相同，僅形態(tài)不同，結(jié)果如表1所示。

表1 大鯢不同可食部位鑒定的揮發(fā)性成分Table 1 Qualitative analysis of volatile compounds in different edible parts of giant salamander

續(xù)表1

圖4 大鯢腹部揮發(fā)性成分GC-IMS定性譜圖Fig. 4 GC-IMS spectrum for qualitative analysis of volatile compounds in abdomen of giant salamander

2.3 大鯢不同可食部位揮發(fā)性成分指紋圖譜

為更好地凸顯大鯢不同可食部位揮發(fā)性成分的差異，對每個不同部位大鯢樣品揮發(fā)性成分平行測試3 次獲得GC-IMS二維圖譜中所有待鑒定信號峰，生成大鯢不同可食部位揮發(fā)性成分指紋圖譜，如圖5所示。從圖5對比分析可知，大鯢不同可食部位揮發(fā)性物質(zhì)成分顯示出了較大差異（圖中紅色框區(qū)域），其中大鯢肉揮發(fā)性物質(zhì)以酮類、酯類、醛類和醇類物質(zhì)占主導(dǎo)，表現(xiàn)出含量相對較高。

由圖5還可看出，大鯢頭部，正己醛、異戊醇、2,3-戊二酮和2-甲基丁酸甲酯含量相對較高；大鯢背部，2,3-己二酮、正己醇、3-戊酮、2-乙基-6-甲基吡嗪和甲酸庚酯（單體、二聚體）含量相對較高；大鯢腹部，醋酸、苯乙醛、異戊醛（單體、二聚體）、二甲基丁醛、3-羥基-2-丁酮含量相對較高；大鯢尾部，丁酸丙酯（單體、二聚體）、2-戊酮和3-戊酮含量相對較高，而2,3-己二酮、正己醇、3-戊酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、甲酸庚酯（單體、二聚體）、苯乙醛、異戊醛（單體、二聚體）和二甲基丁醛含量極低；大鯢爪部，1-辛烯-3-醇、4-甲基-1-戊醇-3-醇（單體、二聚體）、2-戊酮（單體、二聚體）和正丙醇（單體、二聚體）含量相對較高；大鯢肝臟，乙酸乙酯、丙酮、3-羥基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、異戊酸、環(huán)己酮、2-戊酮、正丙醇和苯甲醛含量相對較高。這些分析鑒定的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，可能是大鯢不同部位揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)者。

圖5 大鯢不同可食部位揮發(fā)性成分指紋譜圖Fig. 5 Fingerprints of volatile organic compounds in different edible parts of giant salamander

辛茜等[19]研究表明，采用頂空固相微萃取-GC-MS從大鯢的肉、爪、皮中分別鑒定出57、69、49種揮發(fā)性成分，3個部位共有的揮發(fā)性成分15 種，主要包括醛類、酮類、醇類、酸類、烴類、酯類、胺類等揮發(fā)性成分，其中壬醛、庚醛呈大鯢的魚腥味，1-辛烯-3-醇、1-辛醇呈大鯢的土腥味。本研究鑒定發(fā)現(xiàn)大鯢6個不同部位揮發(fā)性成分主要以酮類、酯類、醇類、醛類為主，未檢測到壬醛、庚醛和1-辛醇，而僅從大鯢爪、尾部檢測到1-辛烯-3-醇，可能是由于檢測方法、原料狀態(tài)、新鮮度、甚至性別等因素造成。此外，大鯢肝臟揮發(fā)性成分呈現(xiàn)出與其他5個部位明顯的差異?？傮w來看，大鯢6個不同部位揮發(fā)性成分具有一定的差異。然而本研究通過GC-IMS只分析鑒定出大鯢不同部位中的34 種揮發(fā)性物質(zhì)，還有15 種化合物由于風(fēng)味成分?jǐn)?shù)據(jù)庫信息不完善，今后尚需要結(jié)合其他文獻(xiàn)報(bào)道以及GC-MS進(jìn)一步定性，這是GC-IMS技術(shù)在食品揮發(fā)性成分分析中存在的共同局限性[25-29]。

2.4 大鯢不同可食部位揮發(fā)性氣味物質(zhì)主成分分析（principal component analysis，PCA）

有研究利用GC-IMS圖譜數(shù)據(jù)結(jié)合PCA，可以根據(jù)揮發(fā)性成分實(shí)現(xiàn)對不同貯藏時(shí)間大菱鲆、不同產(chǎn)地羊肉的區(qū)分[27,32]。本研究將大鯢不同部位的GC-IMS數(shù)據(jù)，根據(jù)不同部位揮發(fā)性氣味指紋進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖6所示。PC1和PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到63%，來源于同一部位大鯢樣品的揮發(fā)性物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)大致聚集在一起，其中，腹部和背部揮發(fā)性成分較接近、尾部和爪部揮發(fā)性成分較為接近，而大鯢肝臟揮發(fā)性成分離其他部位較遠(yuǎn)，說明其揮發(fā)性成分與其他部位明顯不同?？傮w來看，大鯢不同部位揮發(fā)性物質(zhì)沒有明顯重疊區(qū)域，說明采用GC-IMS技術(shù)結(jié)合PCA，可以實(shí)現(xiàn)大鯢不同部位揮發(fā)性成分的較好區(qū)分。

圖6 大鯢不同可食部位揮發(fā)性氣味物質(zhì)PC得分圖Fig. 6 PCA score plot for fingerprints of volatile organic compounds in different edible parts of giant salamander

GC-IMS作為一種新興揮發(fā)性物質(zhì)分析方法，具有響應(yīng)迅速、操作簡單、快速、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。基于GC-IMS聯(lián)用，克服了單一GC方法的不足，在離子遷移管中進(jìn)行二次分離，可大大提高儀器分辨能力和靈敏度，可應(yīng)用于大多數(shù)復(fù)雜體系特征風(fēng)味有機(jī)揮發(fā)組分的快速檢測、識別及指紋圖譜可視化等[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)GC-IMS圖譜數(shù)據(jù)也可用于大鯢不同部位揮發(fā)性成分的識別與區(qū)分，與前人利用GC-IMS結(jié)合PCA，用于食品中不同工藝條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)差異基本一致[25-26,28-29,32]。

3 結(jié) 論

采用GC-IMS技術(shù)對大鯢不同可食部位揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定了34 種揮發(fā)性有機(jī)化合物，包括一些物質(zhì)的二聚體。研究發(fā)現(xiàn)大鯢肉的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，主要包括酯類9種、酮類9種、醛類6 種、醇類7 種、酸類2 種、吡嗪類1 種。大鯢頭部，正己醛、異戊醇、2,3-戊二酮和2-甲基丁酸甲酯含量相對較高；大鯢背部，2,3-己二酮、正己醇、3-戊酮、2-乙基-6-甲基吡嗪和甲酸庚酯（單體、二聚體）含量相對較高；大鯢腹部，醋酸、苯乙醛、異戊醛（單體、二聚體）、二甲基丁醛、3-羥基-2-丁酮含量相對較高；大鯢尾部，丁酸丙酯（單體、二聚體）、2-戊酮和3-戊酮含量相對較高；大鯢爪部，1-辛烯-3-醇、4-甲基-1-戊醇-3-醇（單體、二聚體）、2-戊酮（單體、二聚體）和正丙醇（單體、二聚體）含量相對較高；大鯢肝臟，乙酸乙酯、丙酮、3-羥基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、異戊酸、環(huán)己酮、2-戊酮、正丙醇和苯甲醛含量相對較高。這些揮發(fā)性風(fēng)味化合物，可能是大鯢不同部位揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)者。大鯢不同可食部位揮發(fā)性成分GC-IMS呈現(xiàn)出一定的差異，通過PCA可以實(shí)現(xiàn)不同部位的較好區(qū)分。該研究建立了大鯢不同可食部位揮發(fā)性氣味物質(zhì)指紋圖譜，可視化呈現(xiàn)了大鯢不同部位揮發(fā)性物質(zhì)輪廓，對今后大鯢分割肉品質(zhì)控制、腥味脫除及其產(chǎn)品開發(fā)提供了參考。