王麗紅，楊 輝，蘇 文，孔 陽

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

硒是一種人體和動物必需的微量元素[1-2]，但安全劑量范圍非常窄[3-4]，限制了傳統(tǒng)補硒化合物的使用。研究發(fā)現(xiàn)納米硒具有低毒、高活性、易吸收等優(yōu)勢，因而在抗氧化[5]、抗癌[6]、抗菌[7]、促進生長[8]等方面展現(xiàn)出良好的應用前景。微生物可通過同化還原、異化還原和生物群落甲基化等作用，將環(huán)境中有毒的亞硒酸陰離子還原為毒性較低的單質硒，積累在細胞內或分泌在胞外[9]，合成的納米硒具有典型的紅色球形，穩(wěn)定性好、生物相容性高[10-11]。乳酸菌是一類具有促進生物體腸道內菌群生態(tài)平衡，對宿主起有益調節(jié)作用的微生物菌群，具有公認的安全性（Generally Recognized as Safe，GRAS）[12]。課題組前期研究篩選到1 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP21，具有對亞硒酸鈉耐受能力強、納米硒轉化率高的優(yōu)勢。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）為河口和海洋的正常環(huán)境菌，是各種水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種主要的條件致病菌，容易導致魚蝦等患疾病甚至死亡，是引起海洋動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖大流行性疾病的重要致病菌[13]。為了減輕染病造成的致命后果，目前過度使用抗生素或化學殺菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中很常見，引起超級細菌和耐藥性基因的產(chǎn)生、傳播，已成為危害公共安全問題之一[14-15]。預防和控制水產(chǎn)養(yǎng)殖設施中的致病性感染[16]是目前亟需解決的問題。

納米硒顆粒具有抗菌的特性[17-18]，而且對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和念珠菌（Candidaspp.）具有抗生物膜活性[19]，但是應用于溶藻弧菌的抑菌活性還鮮見報道。本研究擬采用植物乳桿菌LP21在生長繁殖中轉化合成納米硒，利用透射電鏡、粒徑儀、X射線衍射、紅外光譜對制備的納米硒進行結構和性能表征，并對其抑制溶藻弧菌的生長繁殖、運動性、生物膜形成、細胞形態(tài)等進行研究，旨在為漁業(yè)養(yǎng)殖提供一種無毒和有益環(huán)境奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌LP21、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由陜西科技大學1C420實驗室分離保藏；溶藻弧菌（CCCCT No.AB209306）由陜西科技大學食品與生物工程學院劉歡老師提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母菌粉5.0 g、氯化鈉30.0 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂粉（固體培養(yǎng)）15.0～20.0 g。

改良MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g、牛肉膏5.0 g、硫酸錳0.05 g、蛋白胨10.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸氫二鉀2.0 g、吐溫80 1 mL、檸檬酸三銨2.0 g、酵母菌粉4.0 g、蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

亞硒酸鈉 山東西亞試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 西隴科學股份有限公司；過氧化氫、無水乙醇 天津市天力化學試劑有限公司；NaOH、硝酸、高氯酸 天津科密歐化學試劑有限公司；乙酸 天津市北辰方正試劑廠；結晶紫常德比克曼生物科技有限公司；溴化鉀（光譜純）天津恒創(chuàng)立達科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)箱 重慶試驗儀器設備廠；壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械有限公司；紫外-分光光度計 上海光譜儀器有限公司；LGJ-15D冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；Phenom Pro X飛納掃描電鏡 復納科學儀器（上海）有限公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；D/max2200PCX光衍射儀、Vertex70紅外光譜儀德國布魯克公司；Litesizer? 500納米粒度儀 奧地利安東帕有限公司；Scientz-1500F超聲波分散儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；IRIS Intreid II電感耦合等離子發(fā)射光譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌LP21合成納米硒

將活化3 次的植物乳桿菌LP21以2%接種量，接種于含亞硒酸鈉質量濃度1 g/L的改良MRS液體培養(yǎng)基中，其中亞硒酸鈉需單獨滅菌后加入，35 ℃厭氧瓶培養(yǎng)72 h后，10 000 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)蒸餾水洗3 次得到納米硒-植物乳桿菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 透射電鏡觀察納米硒-植物乳桿菌

吸取納米硒-植物乳桿菌滴加于銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余水分，紅外線燈照射干燥后，透射電鏡觀察，能譜儀分析。

1.3.3 納米硒的分離

將納米硒-植物乳桿菌用0.1 g/100 mL SDS（1 mol/L NaOH溶液配制）懸浮，超聲波分散儀300 W，3 s/停3 s，處理15 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液12 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌3 次重懸，然后通過0.45 μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥制備得到納米硒顆粒，進行結構表征及抑菌活性研究。

1.3.4 納米硒粒徑分析

取納米硒重懸，分別滴加于一次性比色皿中，置于納米粒度儀卡槽中，測定粒徑。設定預熱時間120 s，測量溫度25 ℃，測量次數(shù)3 次。

1.3.5 納米硒紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法，傅里葉紅外光譜儀對納米硒進行檢測，光譜測定范圍400～4 000 cm-1。

1.3.6 納米硒X射線衍射分析

采用X射線衍射對納米硒結構進行分析，以CuKα射線為輻射源（λ=0.154 nm），電流50 mA，電壓40 kV。

1.3.7 平板抑菌活性測定

將納米硒-植物乳桿菌、納米硒用硝酸-高氯酸混酸消化，方法詳見文獻[20]，電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測定硒含量，并稀釋到250 μg/mL與相同質量濃度亞硒酸鈉分別制備成樣品1、2、3。對照為植物乳桿菌及0.22 μm濾膜過濾后的發(fā)酵液，分別為樣品4和5。

將指示菌溶藻弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌按1%的接種量分別接入LB液體培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定菌液OD600nm值并稀釋至1.0。培養(yǎng)皿注入20 mL LB固體培養(yǎng)基，水平放置使之凝固，將1 mL指示菌均勻涂布培養(yǎng)基上，放入浸泡有樣品的濾紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，每個處理3個平行。

1.3.8 納米硒對溶藻弧菌生長的影響

采用二倍稀釋法[21]，確定納米硒的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

將指示菌溶藻弧菌按1%的接種量，分別接入添加納米硒亞抑制劑量143 μg/mL的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，以未添加納米硒的無菌培養(yǎng)基為對照，采用比濁法，每隔2 h取出1 mL菌液，3 倍稀釋后600 nm波長處測定OD值，觀察菌體生長情況，繪制生長曲線。

1.3.9 納米硒對溶藻弧菌生物膜形成的抑制

采用結晶紫染色法測定納米硒對溶藻弧菌生物膜的抑制作用。將含亞抑制劑量143 μg/mL納米硒的5 mL LB裝在干凈的無菌玻璃管中，接種0.05 mL溶藻弧菌，以不含納米硒的培養(yǎng)為對照，37 ℃培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，附著的細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，1 g/100 mL結晶紫染色，水沖洗，33%（V/V）乙酸溶液脫色，在570 nm波長處測定洗脫染料OD值。

1.3.10 納米硒對溶藻弧菌運動性的影響

在含瓊脂0.5 g/100 mL（軟板）和1.5 g/100 mL（硬板）固體LB平板上測定納米硒對溶藻弧菌的游動和群集能力的影響。溶藻弧菌分別點樣在含亞抑制劑量納米硒的軟板和硬板上，并用不含納米硒的培養(yǎng)作對照，24 h后拍照記錄。

1.3.11 掃描電鏡觀察納米硒對溶藻弧菌形態(tài)的影響

將指示菌溶藻弧菌按1%的接種量分別接入LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h后，添加納米硒質量濃度為143 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，5 000 r/min離心10 min，PBS洗滌3 次，收集沉淀，乙醇梯度洗脫，樣品處理詳見文獻[22]。掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌LP21轉化合成納米硒形貌觀察

微生物對基質中亞硒酸鹽的還原被認為是菌體的脫毒作用，廣泛被接受的機制是菌體內谷胱甘肽首先提供電子轉化亞硒酸鹽形成硒代谷胱甘肽（GS-Se-SG），然后經(jīng)谷胱甘肽還原酶或硫氧還蛋白還原酶進一步還原，形成不穩(wěn)定谷胱甘肽硒硫化物（GS-Se-），后經(jīng)水解形成還原型谷胱甘肽和單質硒[23]，再通過硒因子A分泌到胞外[24]。植物乳桿菌LP21在生長繁殖中可將環(huán)境中有毒的亞硒酸鈉轉化成低毒的單質硒，分泌在細胞外，活性單質硒具有典型的紅色，透射電鏡觀察菌體及納米硒形貌見圖1A，在菌體細胞周圍游離著球形顆粒，分散性較好。能譜（圖1B）分析其主要組分除菌體的成分C、O外，較多的為元素Se，說明植物乳桿菌的富硒能力較強，除少量存在胞內，大部分會分泌胞外，因而使菌體及培養(yǎng)液呈紅色，而且培養(yǎng)時間越長，顏色越深。

圖1 植物乳桿菌LP21合成納米硒透射電鏡及能譜圖Fig. 1 TEM image and energy spectra of selenium nanoparticles synthesized by L. plantarum LP21

2.2 納米硒粒徑分析

研究表明粒徑在5～200 nm之間的納米硒具有顯著的生物學效應[25-26]，而且粒度越小活性越強[27-28]，采用粒度儀分析植物乳桿菌合成的納米硒粒徑分布如圖2所示?？芍?，植物乳桿菌LP21合成的納米硒顆粒分布在98.7～306.9 nm之間，平均粒徑為184.6 nm。研究表明微生物合成納米硒的尺寸與不同菌種[29]和培養(yǎng)條件如pH值、溫度、接種量、亞硒酸鈉質量濃度以及脅迫時間[30]等有關，而且納米硒粒徑較小的抑菌活性較強。一般微生物合成的納米顆粒介于30～500 nm之間，植物乳桿菌LP21在前期探索實驗條件下合成納米硒顆粒相對較小，因而在生物活性上具有較大優(yōu)勢。

圖2 植物乳桿菌LP21合成的納米硒粒徑分布Fig. 2 Particle size distribution of selenium nanoparticles synthesized by L. plantarum LP21

2.3 納米硒紅外光譜分析

紅外光譜反映了納米硒表面結合的官能團結構，測定納米硒在400～4 000 cm-1紅外光譜范圍內的變化，結果如圖3所示?？芍{米硒在3 435（N-H、O—H）、2 920（CH2、CH3）、1 645（C＝O）、1 378（C—O或C—H）、1 046（C—O）cm-1有伸縮振動及 669（C—H）cm-1處有外彎曲振動。說明納米硒單質不是獨立存在，表面可能結合了蛋白質、多糖等有機物，這與其他微生物合成納米硒的報道基本一致。Xu Chunlan等[31]通過化學成分和元素分析表明干酪乳桿菌合成的納米硒顆粒表面被蛋白質和多糖覆蓋。Kessi等[32]發(fā)現(xiàn)紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）形成硒-蛋白復合物，并且蛋白質起到穩(wěn)定納米硒結構的作用。Dobias等[33]鑒定了大腸桿菌轉化的納米硒與4 種特異性蛋白質（AdhP、Idh、OmpC、AceA）結合，并觀察到在蛋白質存在下，納米硒尺寸分布更窄。在植物乳桿菌LP21合成的納米硒表面存在的多糖、蛋白質等生物分子，能夠有效地避免納米顆粒發(fā)生轉化和團聚，起到天然的穩(wěn)定劑作用，這也是生物法合成納米硒較化學、物理法具有優(yōu)勢的原因之一。

圖3 植物乳桿菌LP21合成的納米硒紅外光譜Fig. 3 FTIR spectrum of selenium nanoparticles synthesized by L. plantarum LP21

2.4 納米硒X射線衍射分析

從圖4可知，納米硒在20°～30°范圍內有較強的衍射峰，無晶體特征吸收峰，說明植物乳桿菌合成的納米硒結晶度較差，屬于無定形態(tài)。目前，由微生物合成的納米硒有晶體[29]和無定形態(tài)[34]，植物乳桿菌合成的納米硒為非晶形態(tài)可能是因為菌體合成的納米硒表面吸附的生物大分子蛋白質、糖類等，阻礙了晶體的長大，因而呈現(xiàn)無定形。

圖4 納米硒顆粒X射線衍射圖Fig. 4 XRD pattern of synthesized selenium nanoparticles

2.5 平板抑菌活性

觀察納米硒對溶藻弧菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的平板抑菌活性發(fā)現(xiàn)，納米硒及納米硒菌體復合物對測試菌均表現(xiàn)一定的抑菌活性，而植物乳桿菌菌體、發(fā)酵液、亞硒酸鈉無明顯抑菌活性。平板抑菌圈測定結果見表1，納米硒及菌體復合物對溶藻弧菌和大腸桿菌的抑制力較強，對金黃色葡萄球菌抑菌活性較低。溶藻弧菌和大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌屬于陽性菌，陽性菌的肽聚糖層較厚，可能影響納米硒顆粒進入細菌胞內，從而影響其抑菌活性。對比納米硒和納米硒復合物的抗菌活性可知，純化納米硒的活性更強，推測可能是納米硒菌體復合物中納米硒易于吸附在菌體表面，不宜在固體平板上擴散，最終降低其抑菌活性。

表1 納米硒平板抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of nano-selenium

2.6 納米硒對溶藻弧菌生長的影響

二倍稀釋法確定納米硒的MIC，結果表明當納米硒質量濃度達到286 μg/mL時，培養(yǎng)中無溶藻弧菌生長，培養(yǎng)液澄清，當質量濃度為143 μg/mL時，培養(yǎng)液出現(xiàn)菌體生長。因此確定納米硒對溶藻弧菌的MIC為286 μg/mL，這與Eleonora等[35]采用生物源納米硒對銅綠假單胞菌的報告基本一致。選擇亞抑制劑量143 μg/mL研究納米硒對溶藻弧菌的抑菌作用。

如圖5所示，納米硒對溶藻弧菌的生長具有明顯的抑制作用，使菌的潛伏期延長，對照組在4 h后開始進入對數(shù)增長期，而納米硒組在8 h才開始進入對數(shù)期，并且比對照組提前進入穩(wěn)定期，發(fā)酵終了溶藻弧菌生長量也較低。說明在亞抑制劑量下納米硒可抑制溶藻弧菌的生長，并使菌體快速衰退死亡。

圖5 納米硒對溶藻弧菌生長曲線影響Fig. 5 Effect of nano-selenium on the growth curve of V. alginolyticus

2.7 納米硒對溶藻弧菌生物膜形成的影響

生物膜是一種基質，可封閉、固著微生物群落，使其附著于非生物和生物表面，可保護微生物免受惡劣環(huán)境及噬菌體、變形蟲捕食，提高其生存能力和環(huán)境耐受性[36-37]。溶藻弧菌在適應自然環(huán)境生長過程中極易在水中形成生物膜，并附著在生物體的表面，被膜內的細菌對抑菌劑的抗逆性增強，很難去除，從而導致持續(xù)性污染[38]。

圖6顯示了納米硒抗生物膜作用，對照組溶藻弧菌在培養(yǎng)基表面及試管壁上形成厚厚的生物膜，納米硒處理組的液體及管壁上形成的生物膜較薄，且未連接成片，結晶紫染色結果表明，納米硒處理的溶藻弧菌形成生物膜生物量降低。因此，納米硒可有效抑制溶藻弧菌生物膜形成，降低溶藻弧菌的感染力。

圖6 納米硒對溶藻弧菌生物膜的抑制Fig. 6 Inhibitory effect of nano-selenium on V. alginolyticus biofilm

2.8 納米硒對溶藻弧菌運動性形成的影響

溶藻弧菌有側鞭毛和極性鞭毛兩個鞭毛系統(tǒng)[39]，具有在液體條件下游動和在固體表面上群集能力，易于游動并聚集感染宿主[40]。如圖7所示，對照組中溶藻弧菌在軟膜和硬膜中擴散面積較大，相比納米硒組對溶藻弧菌的游動和群集都具有較好的抑制，影響了其在基質中運動性，從而降低溶藻弧菌在環(huán)境中擴散、侵染宿主的能力。

圖7 納米硒對溶藻弧菌運動性的影響Fig. 7 Effect of nano-selenium on the mobility of V. alginolyticus

2.9 納米硒對溶藻弧菌形態(tài)的影響

溶藻弧菌生長良好的培養(yǎng)液中添加納米硒，培養(yǎng)24 h后，電鏡觀察納米硒對菌體形態(tài)的影響。從圖8可知，對照組中溶藻弧菌菌體表面光滑，未見異常。而納米硒處理的菌體形態(tài)發(fā)生明顯變化，表面出現(xiàn)塌陷，部分表面出現(xiàn)溶洞，說明納米硒可能影響了溶藻弧菌細胞膜或細胞壁的結構，進一步會導致細胞內容物釋放，菌體死亡。Xu Chunlan等[31]研究在納米硒處理的癌細胞內發(fā)現(xiàn)了納米硒顆粒，說明納米硒可以進入癌細胞內部，最終誘導細胞的凋亡。Zhang Xiaohui等[41]提出抑菌劑“成孔理論”，認為抑菌劑可進入細胞，并使細胞形成可滲透的孔隙通道，導致細胞死亡。植物乳桿菌LP21合成的納米硒可以使生長良好的溶藻弧菌表面出現(xiàn)孔洞，細胞死亡，但有關納米硒在胞內的作用機制還需要進一步研究。

圖8 溶藻弧菌掃描電鏡圖Fig. 8 Scanning electron micrographs of V. alginolyticus treated or not treated with nano-selenium

3 結 論

植物乳桿菌繁殖過程可產(chǎn)生有機酸、細菌素、過氧化氫等代謝產(chǎn)物，不僅具有益生菌調節(jié)生物胃腸道菌群平衡、促進營養(yǎng)物質吸收等功能[42]，而且具有穩(wěn)定水的pH值、抑制底部糞便和殘餌料的腐爛、減少化工降解素用量、降低養(yǎng)殖成本的作用[43]。采用植物乳桿菌LP21合成納米硒，比化學合成法簡單、成本低，并且生物來源的納米硒生物相容性高，易于在體內吸收利用。植物乳桿菌LP21合成的納米硒分泌在細胞外，呈球形，為非晶態(tài)，粒徑分布在98.7～306.9 nm之間，平均粒徑為184.6 nm。納米粒子表面覆蓋蛋白和糖類化合物結合，降低了電位，通過負電荷抑制納米顆粒的團聚，從而維持納米結構的穩(wěn)定。植物乳桿菌LP21合成的納米硒對溶藻弧菌的MIC為286 μg/mL，在143 μg/mL亞抑制劑量條件下對溶藻弧菌的生長繁殖、運動性、生物膜均有顯著抑制，并可造成菌體細胞壁和細胞膜結構變化，引起菌體死亡。目前溶藻弧菌可以在水中游動、聚集形成生物膜，附著于魚、蝦等生物表面引起感染，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。采用植物乳桿菌LP21轉化納米硒，菌體是有益的載體，可作為養(yǎng)殖飼料促進養(yǎng)殖水產(chǎn)的代謝吸收，合成的納米硒具有抑菌溶藻弧菌繁殖、運動、形成生物膜的功效，有望為水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治溶藻弧菌的感染提供新的方法。