鄭嘉偉，王蘭嬌，李大婧，柴 智，張曉曉，黃午陽,*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，存在于很多食品中。花青素對(duì)人類健康有積極的影響，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)視網(wǎng)膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等重要功效[1]。藍(lán)莓含有豐富的花青素。因此有關(guān)藍(lán)莓花青素的研究也不斷深入，其中包括一些有關(guān)基因及其調(diào)控方面的研究。植物花青素生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因可以達(dá)到協(xié)同調(diào)控花青素生成的作用，在紅葡萄中與花青素合成有關(guān)的查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）、尿苷二磷酸-葡萄糖-類黃酮-3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate-glucoseflavonoid-3-glucosyl transferase，UFGT）等結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量均高于白葡萄[2]。CHS是花青素合成途徑中的第一位關(guān)鍵酶，能夠催化生成柚皮素查耳酮，并在查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮-3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）和花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）的連續(xù)作用下形成花青素[3-5]，而花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是合成原花青素的關(guān)鍵酶，在形成花青素后經(jīng)ANR的催化可生成原花青素，而不通過UFGT轉(zhuǎn)化較為穩(wěn)定花色苷[6-7]，通過不同途徑分支消耗相同底物也是花青素合成的一種調(diào)控機(jī)制，可以說ANR基因在花青素的生物合成過程中起負(fù)調(diào)控作用，有研究表明，擬南芥在缺少ANR基因的情況下能夠促使花青素合成，使擬南芥的花青素含量提高[8]。當(dāng)花青素合成遭到阻礙時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)CHS、ANS和UFGT基因的表達(dá)水平大幅度降低[9]。植物中花青素含量受多方面因素影響。一方面，紫外線等外部環(huán)境會(huì)影響花青素生物合成基因的表達(dá)水平，紫外線可以誘導(dǎo)花青素積累在植物組織通過花青素生物合成基因激活，顯著提高花青素化合物的水平[10]。另一方面花青素合成需要兩類基因，一類是編碼直接參與花青素和其他類黃酮形成的酶的結(jié)構(gòu)基因，另一類是控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控基因[11]?；ㄇ嗨氐暮铣赏緩綄俅紊x產(chǎn)物黃酮類的分支，盡管不同物種在花青素的構(gòu)成成分和積累模式上有較大區(qū)別，但其合成時(shí)經(jīng)歷的主要反應(yīng)基本一致[12]。其合成路徑主要分為3個(gè)階段，第1、2階段為類黃酮代謝的反應(yīng)，第3階段為各個(gè)花青素的形成階段。花青素的形成主要依靠CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、ANR等關(guān)鍵酶（圖1）。目前相關(guān)學(xué)者已從金魚草（Antirrhinum majus）、玉米（Zea mays）、楊梅（Myrica rubra）等眾多植物中得到了花青素合成所需酶類的基因[13-15]。

圖1 花青素的生物合成途徑Fig. 1 Anthocyanin biosynthesis pathway

轉(zhuǎn)錄因子又被稱為反式作用因子，它是真核生物當(dāng)中所含的一種DNA結(jié)合蛋白，作用于啟動(dòng)子區(qū)并與順式元件結(jié)合，對(duì)基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[16]。轉(zhuǎn)錄因子在高等植物各組織器官中普遍存在，廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，其作用方式多種多樣，但大多是與特定靶基因上游的特異性核苷酸序列相結(jié)合，調(diào)控下游的基因轉(zhuǎn)錄的一種蛋白。轉(zhuǎn)錄因子特異性地結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，抑制或者促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)具體代謝途徑或生命活動(dòng)的調(diào)控[17]。在植物花青素合成中可能由一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)控結(jié)構(gòu)基因協(xié)同表達(dá)，研究表明花青素在合成過程中，主要由髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）、bHLH、WD40轉(zhuǎn)錄因子及其MBW復(fù)合物分別或共同參與調(diào)控代謝途徑[18]，MYB基因已被證實(shí)是調(diào)控花青素生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子之一[19]。MYB基因家族很大，在植物的不同代謝途徑中能發(fā)揮不同的用途，它能夠參與植物表皮細(xì)胞的分化、輔助氣孔細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、調(diào)控黃酮類化合物的生物合成以及抵抗真菌感染等作用。在參與花青素生物代謝過程時(shí)，MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠通過調(diào)控花青素合成相關(guān)酶基因促進(jìn)花青素的生成，如葡萄中VvMYBPA1能夠調(diào)控CHI基因的表達(dá)，VvMYBBA2能夠促進(jìn)UFGT的表達(dá)[20]。同時(shí)在一些植物研究中發(fā)現(xiàn)其具有負(fù)調(diào)控作用[21]，有研究證實(shí)，在擬南芥中存在的AtMYB4轉(zhuǎn)錄因子能夠通過抑制C4H基因的合成達(dá)到負(fù)向調(diào)控植物對(duì)UV-B耐受性的作用[22]。Yao Gaifang等[23]發(fā)現(xiàn)該基因可調(diào)控花青素合成，且抑制其表達(dá)可促使紅皮梨中花青素生成。R2R3MYB調(diào)節(jié)劑通常是決定花青素積累的關(guān)鍵因素[24-25]。此外，R2R3MYB蛋白的c端序列很長(zhǎng)，它專門控制花青素生物合成、偶聯(lián)和轉(zhuǎn)運(yùn)花青素到液泡中[26]。花青素生物合成是一個(gè)復(fù)雜的體系，具體調(diào)控方式及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究通過分析不同品種藍(lán)莓花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量，進(jìn)而探究其與花青素含量的相關(guān)性及系統(tǒng)發(fā)育，探索花青素生物合成的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8個(gè)品種藍(lán)莓樣品由江蘇省南京市中山植物園中國(guó)科學(xué)院植物研究所提供，產(chǎn)自浙江諸暨。

藍(lán)莓花青素標(biāo)準(zhǔn)品Mv-3-O-gal、Mv-3-O-glc 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Dp-3-O-glc、Cy-3-O-gal、Cy-3-O-ara、Pt-3-O-gal、Pt-3-O-glc 北京索萊寶科技有限公司；Dp-3-O-ara、Pt-3-O-ara 上海吉至生化有限公司；Dp-3-O-gal、Pn-3-O-gal、Cy-3-O-glc 法國(guó)Extrasynthese公司；Mv-3-O-ara 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；乙腈（色譜純）美國(guó)Tedia試劑有限公司；磷酸（色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441） 天根生化科技（北京）有限公司；cDNA合成試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 北京全式金生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AG梯度PCR儀 德國(guó)艾本德股份公司；Applied Biosystems Q3實(shí)時(shí)定量PCR儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì) 基因有限公司；Tg16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Tanon 2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海越磁電子科技有限公司；Thermo Forma 900超低溫冰箱 上海甄明科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素含量的測(cè)定

藍(lán)莓花青素按前期報(bào)道的方法[27]提取后，提取物用0.22 μm聚偏二氟乙烯膜過濾，采用高效液相色譜法測(cè)定各品種藍(lán)莓果花青素提取物中各花青素含量，總花青素含量為各花青素含量的總和，包括酰基化的花青素。1200高效液相色譜儀配置G1311A二元泵和G1315D二極管陣列檢測(cè)器，并采用C18色譜柱進(jìn)行分離。以體積分?jǐn)?shù)1.0%的磷酸緩沖液為流動(dòng)相A，以100%乙腈為流動(dòng)相B。流速0.6 mL/min，運(yùn)行柱溫25 ℃，波長(zhǎng)520 nm。

1.3.2 藍(lán)莓總RNA提取

將存于-80 ℃的樣品放入研缽中，與液氮一起迅速研磨成粉末；向475 μL裂解液中加入25 μLβ-巰基乙醇，隨后加入100 mg樣品粉末并立即旋渦劇烈振蕩混勻，之后參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行藍(lán)莓總RNA提取，以O(shè)D260nm/OD280nm比值檢驗(yàn)RNA純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.3.3 cDNA合成

將提取出的完整RNA稀釋后，用cDNA試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，加入1 000 ng總RNA。

cDNA合成反應(yīng)體系為2 μL的5×PrimeScriptRTMaster Mix（Perfect Real Time）、2 μL總RNA、6 μL RNase-Free ddH2O。反轉(zhuǎn)錄條件為：反轉(zhuǎn)錄（37 ℃反應(yīng)15 min），反轉(zhuǎn)錄酶失活（85 ℃反應(yīng)5 s），4 ℃冷卻。于冰上冷卻后，分裝并置-20 ℃冰箱存儲(chǔ)備用。

1.3.4 實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）測(cè)定

根據(jù)花青素生物合成通路選擇主要結(jié)構(gòu)基因VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR、VcANS、VcANR和轉(zhuǎn)錄因子基因VcMYBPA1進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)參基因準(zhǔn)確平穩(wěn)表達(dá)是real-time PCR結(jié)果的重要決定因素，一般選擇表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的參考基因，如Actin、NCED1、GAPDH、EF-1α、UBQ、SAND等，本研究經(jīng)real-time PCR實(shí)驗(yàn)比對(duì)后，選擇已知的UBQ作為內(nèi)參基因，所用引物見表1[28-29]。

表1 花青素合成相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes involved in anthocyanin synthesis

以cDNA為模板，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，其中cDNA質(zhì)量濃度為50 ng/μL，引物濃度為10 μmol/L。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)為40。反應(yīng)結(jié)束后得到熒光值變化曲線和溶解曲線，以目的基因與內(nèi)參基因Ct值之差計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)差異，參考2-ΔΔCt分析法[30]。

1.3.5 RNA濃度的計(jì)算

超微量紫外分光光度計(jì)用RNase-Free ddH2O調(diào)零后，取2 μL用RNase-Free ddH2O稀釋的藍(lán)莓RNA提取物測(cè)定其OD260nm值，并按照下式計(jì)算RNA質(zhì)量濃度：

質(zhì)量濃度/（ng/μL）=OD260nm×稀釋倍數(shù)×40

1.3.6 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析與數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種藍(lán)莓花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)

2.1.1 相關(guān)結(jié)構(gòu)基因相對(duì)表達(dá)量分析

選取8 種藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行總花青素含量測(cè)定，如圖2所示?？梢钥闯鰣@藍(lán)、藍(lán)美1號(hào)、綠寶石總花青素含量處于較高水平，而海岸、燦爛以及奧尼爾處于較低水平，萊格西和比洛克西處于居中水平。

圖2 8個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)總花青素含量Fig. 2 Total anthocyanin contents of eight blueberry varieties

由表2可以看出，總花青素含量最高的為兔眼藍(lán)莓園藍(lán)，其總花青素含量高達(dá)（2 331.48±67.33）μg/g；其次為南高叢藍(lán)莓藍(lán)美1號(hào)和北高叢藍(lán)莓綠寶石，含量分別為（2 184.07±59.36） μg/g和（2 055.56±61.61） μg/g；而南高叢藍(lán)莓奧尼爾的總花青素含量最低，僅為（554.56±2.83）μg/g，與園藍(lán)相差4 倍多。

表2 8 種藍(lán)莓果實(shí)信息及總花青素含量Table 2 Fruit traits and total anthocyanin contents of eight blueberry varieties

對(duì)6個(gè)藍(lán)莓花青素合成途徑中重要結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)后，使用相對(duì)定量的方式分析其表達(dá)量，如圖3所示，每個(gè)基因均能夠在藍(lán)莓中正常表達(dá)，但相同基因在不同品種藍(lán)莓的表達(dá)量上存在明顯差異。VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR以及VcANS的表達(dá)量在不同品種間的差距較為接近，例如這5個(gè)結(jié)構(gòu)基因均在奧尼爾中呈現(xiàn)出最高表達(dá)量，燦爛的表達(dá)量較高，而藍(lán)美1號(hào)的表達(dá)量均呈現(xiàn)最低狀態(tài)，其余品種之間的5個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量存在較小浮動(dòng)，但整體趨勢(shì)相似；除奧尼爾外，其余品種的VcCHS表達(dá)量均較為接近；比洛克西、燦爛和海岸的VcCHI表達(dá)量相對(duì)較高；萊格西、園藍(lán)和燦爛的VcF3H表達(dá)量相對(duì)較高；園藍(lán)和燦爛的VcDFR表達(dá)量相對(duì)較高；比洛克西、燦爛和海岸的VcANS表達(dá)量相對(duì)較高。而VcANR在不同品種藍(lán)莓間的表達(dá)量與其他5 種基因差異較大，其表達(dá)量最低的品種為綠寶石，表達(dá)量最高的品種為燦爛，萊格西、比洛克西、奧尼爾、藍(lán)美1號(hào)的表達(dá)量也相對(duì)偏高。

圖3 不同品種藍(lán)莓花青素合成各相關(guān)結(jié)構(gòu)基因VcCHS（A）、VcCHI（B）、VcF3H（C）、VcDFR（D）、VcANS（E）、VcANR（F）相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of VcCHS (A), VcCHI (B), VcF3H (C),VcDFR (D), VcANS (E), and VcANR (F) involved in the biosynthesis of anthocyanins in different blueberry varieties

綠寶石的總花青素含量高，雖然其VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因的表達(dá)量均偏低，但VcANR在不同品種藍(lán)莓間的表達(dá)量最低，推測(cè)與其他品種的藍(lán)莓相比，這5 種基因在綠寶石中主要貢獻(xiàn)產(chǎn)生花青素，而其他的類黃酮物質(zhì)如查耳酮、黃酮醇、黃烷醇較少，且由于負(fù)調(diào)控基因VcANR極低，ANR催化花青素生成原花青素分支途徑被抑制，花青素總含量依舊較高；燦爛的VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因表達(dá)量均較為領(lǐng)先，基本處于所有品種藍(lán)莓中的第2位，但其總花青素含量卻僅為一般水平，推測(cè)是由于其VcANR基因表達(dá)量最高，而ANR基因?qū)ㄇ嗨睾铣删哂胸?fù)調(diào)控作用，其表達(dá)量越高，對(duì)花青素合成的影響越大，導(dǎo)致花青素向原花青素的方向轉(zhuǎn)化，致使?fàn)N爛的總花青素含量減少；奧尼爾的VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因表達(dá)量均呈現(xiàn)最高狀態(tài)，其VcANR基因表達(dá)量居于中等位置，但其總花青素含量在8 種藍(lán)莓中最低，這可能是VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR主要貢獻(xiàn)生成其他類黃酮物質(zhì)，而且由于其含有一些VcANR基因使其花青素含量降低，但其VcANR基因表達(dá)量不足以使其花青素含量降低至此，可能還存在其他基因調(diào)控或影響因素導(dǎo)致其花青素含量大幅度減小。同樣，藍(lán)美1號(hào)VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因表達(dá)量均呈現(xiàn)最低狀態(tài)，而VcANR基因表達(dá)量最高，但總花青素含量在8 種藍(lán)莓中偏高，也可能是其他基因（如UFGT等）調(diào)控。

整體來看，花青素合成途徑的關(guān)鍵酶基因都對(duì)最終花青素的生成量起到一定作用，其中VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因負(fù)責(zé)催化生成花青素，對(duì)花青素合成起到明顯的正調(diào)控作用；而VcANR基因?qū)ㄇ嗨氐暮铣捎胸?fù)調(diào)控作用，能夠?qū)a(chǎn)生的花青素催化形成原花青素，最終使藍(lán)莓花青素含量降低。然而單憑這些基因的作用并不能解釋所有藍(lán)莓花青素含量與相關(guān)基因表達(dá)量的關(guān)系，仍需從多種角度做進(jìn)一步研究。

從不同品種藍(lán)莓中各基因表達(dá)量對(duì)比可以看出，萊格西、比洛克西、藍(lán)美1號(hào)和燦爛中VcANR基因表達(dá)量最高，證明該基因在這些品種藍(lán)莓花青素合成中積極參與，而在奧尼爾、綠寶石中VcANR基因表達(dá)量最低，說明該基因在這兩種藍(lán)莓中的作用不十分明顯；園藍(lán)和綠寶石中VcF3H基因以及海岸中VcANS基因在其對(duì)應(yīng)品種藍(lán)莓花青素的合成過程中參與性最強(qiáng)；萊格西、比洛克西、園藍(lán)和燦爛的VcCHS基因以及藍(lán)美1號(hào)和海岸的VcDFR基因在其對(duì)應(yīng)品種藍(lán)莓花青素合成中的作用較弱。

整體來看，VcANR和VcF3H基因在藍(lán)莓花青素合成過程中基本能夠呈現(xiàn)出表達(dá)量較高的態(tài)勢(shì)，而VcCHS、VcANS和VcDFR基因通常表達(dá)量較低?？梢姴煌贩N的藍(lán)莓中各基因的表達(dá)情況及參與程度存在差異，使得不同品種的藍(lán)莓最終表現(xiàn)出不同的花青素含量。

2.1.2 相關(guān)調(diào)控基因相對(duì)表達(dá)量分析

本實(shí)驗(yàn)部分品種藍(lán)莓的MYB表達(dá)量極低，也可能是由于不同藍(lán)莓植株間存在遺傳差異性或果實(shí)空間分布對(duì)環(huán)境信號(hào)的敏感度不同，一般來說，果實(shí)表面的光照分布也可能是影響MYB表達(dá)水平不明顯的因素，已有研究人員在蘋果中分離出調(diào)控果皮花青素合成的MdMYB1轉(zhuǎn)錄因子，并發(fā)現(xiàn)光照誘導(dǎo)對(duì)該基因表達(dá)量的影響很大[31]。

圖4為不同品種藍(lán)莓VcMYBPA1轉(zhuǎn)錄因子基因的相對(duì)表達(dá)量，其在所有品種中均存在表達(dá)，但品種間存在較大差異?？梢钥闯鰥W尼爾的VcMYBPA1基因表達(dá)量最高，其次為燦爛，約為奧尼爾的1/2；萊格西、比洛克西的表達(dá)量為中等水平；藍(lán)美1號(hào)、園藍(lán)和海岸的基因表達(dá)量較低，而綠寶石的VcMYBPA1基因表達(dá)量最低。藍(lán)莓VcMYBPA1基因表達(dá)量的整體趨勢(shì)與VcCHS基因表達(dá)量最為相似，可能在更大程度上通過調(diào)控VcCHS基因影響花青素的合成。

圖4 不同品種藍(lán)莓MYB調(diào)控基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of MYB-regulated genes in different blueberry varieties

將圖4與圖2對(duì)比來看，VcMYBPA1基因表達(dá)量最高的奧尼爾，其花青素含量最低，VcMYBPA1基因表達(dá)量較高的燦爛，其花青素含量也僅為中等水平，造成這種現(xiàn)象可能是VcMYBPA1轉(zhuǎn)錄因子反饋抑制，對(duì)其產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，使得花青素含量降低；VcMYBPA1基因表達(dá)量處于中間位置的萊格西、比洛克西，其花青素含量無明顯變化趨勢(shì)；而VcMYBPA1基因表達(dá)量較低的藍(lán)美1號(hào)、園藍(lán)、綠寶石和海岸的花青素含量卻相對(duì)偏高，尤其是園藍(lán)、藍(lán)美1號(hào)和綠寶石的花青素含量明顯高于其他品種，居前3位，可能是少量的VcMYBPA1對(duì)其產(chǎn)生正調(diào)控作用，促進(jìn)花青素的生成。以此推測(cè)MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)ㄇ嗨氐纳锖铣僧a(chǎn)生促進(jìn)作用還是抑制或限制花青素的合成，與MYB基因表達(dá)量有關(guān)，當(dāng)MYB基因表達(dá)量過高時(shí)，其可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用影響花青素的合成，使藍(lán)莓花青素含量降低；當(dāng)MYB基因表達(dá)量處于中等水平時(shí)，其對(duì)花青素合成的調(diào)控作用不十分明顯；當(dāng)MYB基因表達(dá)量較低時(shí)，其能夠發(fā)揮正調(diào)控作用促進(jìn)花青素的合成，從而生成更多的藍(lán)莓花青素；這之間可能存在一定的平衡點(diǎn)，當(dāng)MYB基因表達(dá)量超過平衡點(diǎn)時(shí)則發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，低于平衡點(diǎn)則有益于花青素的合成。

2.2 不同品種藍(lán)莓花青素生物合成相關(guān)基因分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)上述real-time PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析后，得到其反向互補(bǔ)序列，上傳至GenBank，并利用BLAST工具將其與數(shù)據(jù)庫中的同種基因進(jìn)行比對(duì)，選擇一致性較高的基因采用NJ法構(gòu)建分子進(jìn)化樹，上傳基因和比對(duì)基因及其序列號(hào)如表3、4所示，根據(jù)其置信度辨別樣品藍(lán)莓基因與數(shù)據(jù)庫中基因的親緣關(guān)系。

表3 檢測(cè)藍(lán)莓樣品的基因序列號(hào)Table 3 GeneBank accession numbers of anthocyanin biosynthesisrelated genes in blueberry samples

表4 參比基因及其序列號(hào)Table 4 GeneBank accession numbers of reference genes

樣品藍(lán)莓為越橘屬植物，GenBank樣品名稱包括萊格西、比洛克西、奧尼爾、藍(lán)美1號(hào)、園藍(lán)、燦爛、綠寶石和海岸。如圖5系統(tǒng)發(fā)育樹和序列比對(duì)結(jié)果顯示，越橘屬（Vacciniumspp.）和油茶屬（Camellia）的ANR基因功能相近，而與其他物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)圖6也可知二者的蛋白結(jié)構(gòu)域也較為相似，因此越橘屬的ANR基因可能是由油茶屬進(jìn)化而來。ANR基因在越橘屬中保守性較高（93.38%），在相同譜系的不同種中均存在較為一致的保守序列。

圖5 ANR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of ANR gene

圖6 越橘屬（A）和油茶屬（B）ANR蛋白結(jié)構(gòu)域Fig. 6 ANR protein domains of Vaccinium (A) and Camellia (B)

ANS（97.4%）、CHI（94.83%）、CHS（98.72%）、DFR（94.48%）、F3H（99.45%）在越橘屬中保守性均很高，但與其他物種之間存在較大差異，表明這些基因在物種分化后可能獨(dú)立進(jìn)化，并在不同物種中趨于保守。植物轉(zhuǎn)錄因子MYB是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示，本研究所測(cè)序的MYB蛋白序列屬于I類MYB基因家族成員1R-MYB/MYB-related[32]，越橘屬與油茶屬的MYB基因具有很近的親緣關(guān)系，該基因在越橘屬、油茶屬及櫟屬（Quercus）中均屬于同一個(gè)基因家族成員，可能由共同的祖先分化而來，并發(fā)揮相似功能。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)藍(lán)莓花青素合成途徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR、VcANS、VcANR和轉(zhuǎn)錄因子基因VcMYBPA1進(jìn)行real-time PCR測(cè)定得到其相對(duì)表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，以上所有基因在藍(lán)莓中均有表達(dá)，但不同品種的藍(lán)莓間存在較大差異，其中VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因?qū)ㄇ嗨氐暮铣捎姓{(diào)控作用，能夠促進(jìn)花青素的生成；但VcANR基因?qū)ㄇ嗨氐暮铣捎胸?fù)調(diào)控作用，可使藍(lán)莓花青素含量降低；VcANR和VcF3H基因在藍(lán)莓花青素合成過程中普遍較為活躍，而VcCHS、VcANS和VcDFR基因則相對(duì)保守；MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花青素合成的調(diào)控作用相對(duì)復(fù)雜，與MYB基因的表達(dá)量有關(guān)，當(dāng)MYB基因表達(dá)量過高時(shí)，可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用降低藍(lán)莓花青素含量；當(dāng)MYB基因表達(dá)量處于中等水平時(shí)，其對(duì)花青素合成的調(diào)控作用不顯著；當(dāng)MYB基因表達(dá)量較低時(shí)，能夠促進(jìn)花青素的合成?；ㄇ嗨氐暮铣蛇€與其他調(diào)控因子及影響因素有關(guān)，具體調(diào)控方式及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究系統(tǒng)測(cè)定不同藍(lán)莓品種花青素合成相關(guān)基因的序列并進(jìn)行分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育分析。在藍(lán)莓花青素合成相關(guān)基因的進(jìn)化過程中，其ANR基因與油茶屬ANR基因功能相似，并且二者的蛋白結(jié)構(gòu)域也較相似，推測(cè)越橘屬植物與油茶屬是近源關(guān)系；藍(lán)莓MYB基因與油茶屬M(fèi)YB基因的親緣關(guān)系也很近，且該基因在越橘屬、油茶屬及櫟屬中為同一基因家族成員，可能由共同的祖先分化而來；ANS、CHI、CHS、DFR和F3H基因在越橘屬中的保守性很高，與其他物種間存在較大差異，可見這些基因在物種分化后可能會(huì)發(fā)生獨(dú)立進(jìn)化。藍(lán)莓花青素合成相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，有助于了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律，指導(dǎo)優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓品種的選育?？傊{(lán)莓花青素的生物合成受類別、品種、種植地區(qū)、基因調(diào)控等多方面因素的影響，本研究探索不同品種藍(lán)莓花青素生物合成相關(guān)基因表達(dá)量和分子進(jìn)化，為開發(fā)優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓品種花青素類功能性食品提供理論依據(jù)。