李天慧，陳春旭,2，陳貴杰，孫 怡，曾曉雄,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）作為一種重要的免疫活性物質(zhì)[1]，不僅存在于體液中，也是牛初乳中的主要抗體之一[2]，其主要功能是負(fù)責(zé)識別、中和以及消除病原體和有毒抗原帶來的危害[3]。IgG由具有可變和恒定結(jié)構(gòu)域的2 條相同重鏈和輕鏈組成[4]，其識別結(jié)合功能主要發(fā)生在抗原結(jié)合片段（Fab）的可變域，而可結(jié)晶片段（Fc）的恒定域則與效應(yīng)分子和細(xì)胞的相互作用相關(guān)[5]。作為一種糖蛋白，IgG的糖基化結(jié)構(gòu)與其功能緊密相關(guān)。IgG的糖基化在其Fab與Fc片段均可以發(fā)生，F(xiàn)c片段包含至少2個保守的N-糖基化位點[1]，而Fab片段存在15%～25%的N-糖基化[6]。IgG的N-糖基化已被證明與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。例如，IgG的末端半乳糖和唾液酸含量可作為炎性疾病子宮內(nèi)膜異位癥診斷的補(bǔ)充參數(shù)[9]；改變IgG的糖基化類型可作為治療溶骨性骨質(zhì)疾病的一種治療手段[10]。此外，并非只有內(nèi)源性IgG可以參與免疫調(diào)節(jié)，外源性IgG對人體也有積極作用。Kaneko等[3]發(fā)現(xiàn)唾液酸化IgG對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠有良好的治療效果；Pagan等[11]設(shè)計并構(gòu)建了2 種可溶性糖基轉(zhuǎn)移酶，可在體內(nèi)將內(nèi)源性IgG轉(zhuǎn)化為抗炎介質(zhì)。本課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)，完整進(jìn)入結(jié)腸的唾液酸化IgG能夠通過調(diào)節(jié)菌株共生關(guān)系顯著促進(jìn)成人腸道中雙歧桿菌的增殖[12-13]。因此，作為糖基化結(jié)構(gòu)的一種，唾液酸化IgG有著重要的研究價值。

盡管唾液酸化IgG具有相當(dāng)大的潛在功能，但僅有5%～10%的IgG的N-糖鏈末端被唾液酸修飾[14]。而且人源與其他動物來源的唾液酸并不相同，人源IgG（human IgG，hIgG）的唾液酸為N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac），動物源如牛IgG（bovine IgG，bIgG）中的唾液酸主要為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）。有研究表明非人源的唾液酸與某些疾病如癌癥或慢性炎癥有關(guān)[15-16]。不僅完整的唾液酸化hIgG有著積極的營養(yǎng)功能，其Fc片段也具備抗炎活性。Fc片段是發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分[3,11,17-18]，通常利用木瓜蛋白酶酶切IgG并純化制備Fc片段[19-21]。因此，本研究擬通過神經(jīng)氨酸酶將bIgG中Neu5Gc殘基水解，利用β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-galactosyltransferase，B4GALT1）和α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（α-2,6-sialyltransferase，ST6GAL1）提高bIgG的Neu5Ac水平，實現(xiàn)bIgG的hIgG轉(zhuǎn)化，并使用木瓜蛋白酶及Protein G蛋白柱制備純化hIgG的Fc片段，為后續(xù)研究唾液酸化hIgG及其Fc片段的生物活性（如抗炎癥和調(diào)節(jié)腸道微生物等活性）提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

bIgG 北京索萊寶科技有限公司；神經(jīng)氨酸酶（50 000 U/mL） 美國NEB公司；B4GALT1、尿苷二磷酸半乳糖（uridine 5’-diphosphogalactose，UDP-Gal）、胞苷一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸（cytidine monophosphospate-sialic acid，CMP-SA） 廣州昂飛美侖生物科技有限公司；ST6GAL1（≥5 U/mg）美國Sigma公司；木瓜蛋白酶（≥2 000 U/mg）生工生物工程（上海）股份有限公司；Protein G蛋白柱上海翌圣生物公司；1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯雙鹽酸鹽（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）、Neu5Gc、Neu5Ac 上海源葉生物科技有限公司；Fc片段標(biāo)準(zhǔn)品 美國Jackson ImmunoResearch公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本島津公司；TSK-gel G4000 PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm） 日本東曹株式會社；PowPacTM高電流電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 bIgG中唾液酸含量的測定及神經(jīng)氨酸酶水解條件的優(yōu)化

1.3.1.1 Neu5Gc、Neu5Ac系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量Neu5Gc、Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用超純水溶解并定容至500 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。吸取標(biāo)準(zhǔn)母液各500 μL配制2 種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，梯度稀釋后配制成2 種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度梯度均為0.000 64、0.003 2、0.016、0.08、0.4、2、10 μg/mL的系列Neu5Gc、Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.1.2 bIgG中唾液酸的酸水解優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法并作適當(dāng)修改。稱取一定量bIgG干粉，配制1 mg/mL IgG溶液，取300 mL IgG溶液加入100 μL 0.1 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）或100 μL 2 mol/L乙酸溶液于80 ℃水浴1 h進(jìn)行唾液酸殘基水解。

1.3.1.3 神經(jīng)氨酸酶水解bIgG唾液酸殘基條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[3]的方法并作適當(dāng)修改。對神經(jīng)氨酸酶水解bIgG唾液酸殘基的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化與選擇。選擇4、20、40、50 mg/mL bIgG，加入170 U/mL神經(jīng)氨酸酶，反應(yīng)體系為5.0 mmol/L CaCl2、50.0 mmol/L醋酸鈉的緩沖溶液，pH 7.5，反應(yīng)48 h。

1.3.1.4 衍生反應(yīng)

取1.3.1.2節(jié)酸水解產(chǎn)物和1.3.1.3節(jié)酶水解產(chǎn)物，加入等體積甲醇，并蒸發(fā)至干，加300 μL超純水復(fù)溶后，加入50 μL DMB衍生液（8 mmol/L DMB、14 mmol/L連二亞硫酸鈉、0.8 mol/Lβ-巰基乙醇、1.5 mol/L冰醋酸）[22]，50 ℃避光反應(yīng)2.5 h，產(chǎn)物以0.45 μm濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.3.1.5 HPLC分析

使用InertSustain C18色譜柱對bIgG中2 種唾液酸進(jìn)行分離和檢測，柱溫30 ℃，熒光檢測器激發(fā)波長373 nm、發(fā)射波長448 nm，流動相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（超純水）＝7∶8∶85，流速0.9 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。分別以Neu5Gc、Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算Neu5Gc、Neu5Ac含量，結(jié)果以每毫克bIgG計。

1.3.2 Protein G蛋白柱純化

將唾液酸酶水解后的bIgG經(jīng)過Protein G抗體純化柱純化去除神經(jīng)氨酸酶、唾液酸等，首先用5 倍柱體積的pH 7.0 20 mmol/L Na2HPO4緩沖液平衡層析柱，然后將樣品加到平衡好的Protein G柱中，上樣量30.0 mg IgG，保證目的蛋白與樹脂充分接觸，收集流出液；用10～15 倍柱體積的pH 7.0 20 mmol/L Na2HPO4緩沖液清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白；最后使用5～10 倍柱體積的pH 3.0 0.1 mol/L甘氨酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即為目的蛋白組分。

1.3.3 體外半乳糖基化和唾液酸糖基化

參考文獻(xiàn)[18,23]報道的方法并作適當(dāng)修改。反應(yīng)體系中底物IgG終質(zhì)量濃度7.5 mg/mL、UDP-Gal終濃度2 mmol/L、CMP-SA終濃度2 mmol/L、B4GALT1和ST6GAL1添加量分別為25 mU/10 mg（以IgG質(zhì)量計），反應(yīng)緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L MgCl2），pH 7.5、37 ℃反應(yīng)48 h。根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]的方法，采用反相離子對液相色譜（reversed phase ion-pair chromatography，RPIC）法分析反應(yīng)產(chǎn)物，流動相為V（0.01 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）-1.45 mmol/L四丁基硫酸氫銨）∶V（乙腈）＝97∶3，色譜柱為Inertsil ODS-3色譜柱，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm。

1.3.4 Fc片段制備條件的優(yōu)化

參考Guerrier等[26]報道的方法，對木瓜蛋白酶酶解由bIgG轉(zhuǎn)化的hIgG制備Fc片段的條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4.1 半胱氨酸溶液濃度對Fc片段制備的影響

稱取5 份10 mg制備的hIgG溶解于1.0 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（含0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，pH 7.0）中，hIgG質(zhì)量濃度10 mg/mL，再分別加入20.0 μL 0.1 mol/L EDTA溶液（pH 7.0）和終濃度為0、10、20、40、80 mmol/L半胱氨酸溶液，置于37 ℃水浴鍋中酶解4 h，反應(yīng)結(jié)束后加入0.2 mol/L碘乙酰胺溶液100 μL，冰浴0.5 h終止反應(yīng)。制備5%濃縮膠和12%分離膠，濃縮膠電壓80 V、電泳30 min，分離膠電壓120 V、電泳60 min，隨后對蛋白膠進(jìn)行染色、脫色等步驟進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.4.2 酶添加量對Fc片段制備的影響

稱取3 份10 mg制備的hIgG分別溶解于1.0 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（其中m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）分別為0.025、0.05、0.1，pH 7.0）中，hIgG質(zhì)量濃度為10 mg/mL，再加入20.0 μL 0.1 mol/L EDTA溶液（pH 7.0）和終濃度10.0 mmol/L半胱氨酸溶液，置于37 ℃水浴鍋中酶解4 h，反應(yīng)結(jié)束后加入0.2 mol/L碘乙酰胺溶液100 μL，冰浴0.5 h終止反應(yīng)。然后按1.3.4.1節(jié)步驟進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.4.3 酶解時間對Fc片段制備的影響

稱取4 份10.0 mg制備的hIgG溶解于1.0 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（含0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，pH 7.0）中，hIgG質(zhì)量濃度為10 mg/mL，再加入20.0 μL 0.1 mol/L EDTA溶液（pH 7.0）和終濃度10.0 mmol/L半胱氨酸溶液，置于37 ℃水浴鍋中分別酶解2、3、4、5 h，反應(yīng)結(jié)束后加入0.2 mol/L碘乙酰胺溶液100 μL，冰浴0.5 h終止反應(yīng)。然后按1.3.4.1節(jié)步驟進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.5 HPLC定量檢測hIgG及其Fc片段

根據(jù)文獻(xiàn)[11]報道的方法，使用TSK-gel G4000 PWXL色譜柱，流動相為含0.3 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，流速0.6 mL/min，柱箱溫度30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長280 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 bIgG中唾液酸殘基的含量

圖1 Neu5Gc和Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品（A）、0.1 mol/L TFA水解樣品（B）、2.0 mol/L乙酸水解樣品（C）、170 U/mL神經(jīng)氨酸酶水解樣品（D）HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of Neu5Gc and Neu5Ac standards (A),0.1 mol/L TFA-hydrolyzed sample (B), 2.0 mol/L acetic acid-hydrolyzed sample (C), 170 U/mL neuraminidase-hydrolyzed sample (D)

如圖1所示，在15.6 min和20.5 min出現(xiàn)2個峰分別為Neu5Gc和Neu5Ac，不存在明顯拖尾現(xiàn)象，分離效果良好。將2 種唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行DMB衍生反應(yīng)后進(jìn)行HPLC檢測，分別以Neu5Gc、Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程：Neu5Gc：y＝7×106x-11 215（R2＝0.999 9）；Neu5Ac：y＝9×106x+341 812（R2＝0.999 3），在質(zhì)量濃度0.000 64～10 μg/mL范圍內(nèi)均線性良好。

圖2 TFA與乙酸水解方式下bIgG中唾液酸含量Fig. 2 Sialic acid contents in bIgG hydrolyzed by TFA or acetic acid

如圖2所示，對比0.1 mol/L TFA和2.0 mol/L乙酸2 種酸水解方式下bIgG中唾液酸殘基的水解情況發(fā)現(xiàn)，0.1 mol/L TFA水解更加徹底。當(dāng)采用0.1 mol/L TFA水解bIgG時，HPLC檢測結(jié)果表明，bIgG中Neu5Gc含量為（0.816±0.009）μg/mg，Neu5Ac含量為（0.099±0.003）μg/mg，即1 mol bIgG中所含2 種唾液酸總物質(zhì)的量為（0.424±0.006）mol，其中n（Neu5Gc）∶n（Neu5Ac）為7.8∶1，Neu5Ac含量遠(yuǎn)低于Neu5Gc，說明在bIgG中Neu5Gc是唾液酸最主要的存在形式。Ma Li等[27]檢測得到中國6 家廠商生產(chǎn)的每1 mol靜脈注射人免疫球蛋白的唾液酸化水平為0.875～1.085 mol。表明bIgG的唾液酸化程度低于hIgG的唾液酸化程度。

2.2 神經(jīng)氨酸酶水解bIgG中唾液酸殘基條件的優(yōu)化結(jié)果

為優(yōu)化神經(jīng)氨酸酶水解bIgG中唾液酸殘基條件，固定神經(jīng)氨酸酶添加量（170 U/mL），當(dāng)bIgG質(zhì)量濃度分別為4、20、40、50 mg/mL時，將0.1 mol/L TFA酸水解bIgG得到Neu5Gc的解離率視作100%。由表1可知，當(dāng)bIgG質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，170 U/mL神經(jīng)氨酸酶水解bIgG較為徹底，與0.1 mol/L TFA水解效果相當(dāng)；隨著bIgG質(zhì)量濃度的升高，解離率下降，這可能是由于當(dāng)?shù)孜颾IgG質(zhì)量濃度超出一定范圍后，酶促反應(yīng)速率不再增大，產(chǎn)物Neu5Gc物質(zhì)的量達(dá)到一定值，計算所得的Neu5Gc解離效率隨之下降。因此，以4 mg/mL作為神經(jīng)氨酸酶酶解反應(yīng)中bIgG質(zhì)量濃度。利用酶法將Neu5Gc從bIgG末端解離，與酸水解相比，酶水解對底物更加專一，且這一反應(yīng)能夠在一定程度上降低通過食用動物源食品攝入Neu5Gc造成的致癌等潛在風(fēng)險[28-30]。

表1 不同bIgG質(zhì)量濃度的神經(jīng)氨酸酶水解樣品中Neu5Gc含量Table 1 Neu5Gc contents in neuraminidase-hydrolyzed samples with different bIgG concentrations

2.3 hIgG的合成

為除去神經(jīng)氨酸酶和游離的唾液酸等雜質(zhì)的影響，bIgG經(jīng)酶水解后用Protein G蛋白柱進(jìn)行純化，純化后樣品再利用B4GALT1、ST6GAL1和供體UDP-Gal、CMP-SA合成hIgG。由于UDP-Gal和CMP-SA被相應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶將半乳糖和Neu5Ac被轉(zhuǎn)移至IgG[31-32]，同時產(chǎn)生UDP和CMP，因此利用RPIC檢測UDP和CMP水平，對供體轉(zhuǎn)移效果進(jìn)行間接檢測。

圖3 核苷酸與核苷酸糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）、體外糖基化后hIgG樣品中游離核苷酸與核苷酸糖（B）的RPIC圖Fig. 3 Reversed-phase ion-pair chromatograms of nucleotide sugars and nucleotide standards (A), and free nucleotides and nucleotide sugars in in vitro glycosylated hIgG samples (B)

表2 核苷酸與核苷酸糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves for nucleotides and nucleotide sugars

表3 反應(yīng)結(jié)束后不同時間點檢測樣品中游離核苷酸與核苷酸糖含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Relative standard deviations for free nucleotides and nucleotide sugars in samples analyzed at different times after reaction

表4 RPIC法檢測樣品中核苷酸與核苷酸糖含量的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果Table 4 Results of precision, repeatability and stability of RPIC for the determination of nucleotides and nucleotide sugars

由圖3可知，CMP、UDP、CMP-SA、UDP-Gal分別在第14.7、18.6、26.4、30.5分鐘時出峰，分離明顯，標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，在0.05～1 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。反應(yīng)結(jié)束后不同時間點檢測樣品中游離核苷酸與核苷酸糖的含量，由表3可知，樣品中核苷酸類物質(zhì)含量檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在反應(yīng)結(jié)束后0～3 h內(nèi)較好，因此實驗樣品應(yīng)在3 h內(nèi)進(jìn)行HPLC測定。此外，方法的精密度和重復(fù)性也較好（表4）。在此基礎(chǔ)上，對體外糖基化hIgG樣品中游離核苷酸與核苷酸糖含量進(jìn)行分析，以增加的游離CMP和UDP物質(zhì)的量作為轉(zhuǎn)移糖基的物質(zhì)的量進(jìn)行計算，結(jié)果表明，平均每分子IgG約增加了8.4個半乳糖殘基和42個唾液酸殘基。唾液酸殘基的轉(zhuǎn)移效果明顯優(yōu)于半乳糖殘基的轉(zhuǎn)移效果，這可能與bIgG中Neu5Gc殘基被水解后，暴露出半乳糖殘基，不利于半乳糖殘基的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實驗利用2 種糖基轉(zhuǎn)移酶將半乳糖和Neu5Ac轉(zhuǎn)移至IgG，為制備抗炎癥介質(zhì)提供了思路。

2.4 酶解hIgG制備Fc片段的條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 半胱氨酸濃度

木瓜蛋白酶是一種巰基蛋白酶，因此需要還原劑激活蛋白酶以發(fā)生反應(yīng)，但過量的激活劑會將IgG進(jìn)一步還原為更小的片段[33]。如圖4所示，不添加半胱氨酸的酶解產(chǎn)物與添加半胱氨酸的酶解產(chǎn)物條帶明顯不同，添加半胱氨酸后，F(xiàn)(ab’)2片段（約110 kDa）轉(zhuǎn)化為Fab片段[33]。隨著半胱氨酸濃度增加，完整的hIgG條帶（150.0 kDa）灰度明顯變淺，說明酶解程度增加。但同時2 條Fc條帶灰度也隨著激活劑半胱氨酸濃度的增加而減小，可能是半胱氨酸的還原作用將雙鏈Fc片段還原為單鏈或更小的片段。當(dāng)半胱氨酸濃度為20、40、80 mmol/L時，高分子質(zhì)量Fc片段已不明顯，因此選擇10 mmol/L作為激活劑半胱氨酸的濃度。

圖4 不同半胱氨酸濃度下木瓜蛋白酶水解hIgG產(chǎn)物的非還原SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Non-reducing SDS-PAGE profile of hIgG hydrolyzed by papain with different cysteine concentrations

2.4.2 木瓜蛋白酶添加量和酶解時間

由圖5可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，hIgG條帶逐漸變淺；隨著酶解效率進(jìn)一步升高，高分子質(zhì)量Fc條帶變淺，這可能是由于木瓜蛋白酶作用于次級酶切位點將Fc片段水解為更小的片段。通常認(rèn)為，木瓜蛋白酶水解IgG分為多個步驟，主要酶切位點位于鉸鏈區(qū)，而Fc片段中也存在2個次級酶切位點，分別位于C段第14位和第105位氨基酸殘基處。因此，F(xiàn)c片段可進(jìn)一步被水解為3個片段：C端短片段（約3.0 kDa）、包含2個CH3結(jié)構(gòu)域的片段（約21.0 kDa）以及包含2個CH2結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的片段（約28.0 kDa）[34]。由此推測，隨著酶添加量的增加，木瓜蛋白酶作用于Fc片段的次級酶切位點將其水解為更小的片段。因此，選擇m（木瓜蛋白酶）：m（hIgG）為0.05作為木瓜蛋白酶最適添加量，以在保證酶解效率的同時得到較高純度的Fc片段。

圖5 不同酶添加量和酶解時間下木瓜蛋白酶水解hIgG產(chǎn)物的非還原SDS-PAGE圖譜Fig. 5 Non-reducing SDS-PAGE profiles of papain hydrolyzed hIgG products at different enzyme dosages and hydrolysis times

此外，隨著酶解時間的延長，hIgG條帶逐漸變淺，說明hIgG被酶解的更加徹底，但是不同酶解時間2 條Fc片段條帶灰度差異并不明顯，且酶解2 h后，F(xiàn)c片段條帶已較為明顯，為避免酶解時間過長導(dǎo)致木瓜蛋白酶作用于次級酶切位點使Fc片段被進(jìn)一步酶解為更小片段或被半胱氨酸還原劑還原成單鏈[35]，因此選擇酶解時間為3 h。

綜合對激活劑半胱氨酸濃度、木瓜蛋白酶添加量和酶解時間的條件優(yōu)化，最終優(yōu)化條件為：10 mg/mL hIgG、m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）＝0.05、10 mmol/L半胱氨酸、2 mmol/L EDTA溶液、pH 7、酶解時間3 h。

2.5 hIgG及其Fc片段得率

圖6 hIgG（A）和hIgG Fc片段（B）的HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatograms of hIgG (A) and Fc fragment (B)

表5 hIgG和hIgG Fc片段標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Standard curves for hIgG and Fc fragment

采用HPLC方法對hIgG及hIgG Fc片段進(jìn)行定量分析，如圖6所示，hIgG和hIgG Fc片段的保留時間分別為14.2 min和15.1 min，hIgG和hIgG Fc片段標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表5所示，在0.07～4.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，95.0 mg bIgG最終得到67.2 mg體外糖基化hIgG，得率為71.7%，40.0 mg體外糖基化hIgG原料經(jīng)過木瓜蛋白酶水解后可以得到8.3 mg Fc片段，F(xiàn)c片段得率為20.8%。理論上，F(xiàn)c片段分子質(zhì)量約為IgG的1/3，則40.0 mg hIgG中的Fc片段質(zhì)量為13.3 mg，而實驗檢測所得僅為8.3 mg，造成損失的原因可能由于Protein G蛋白柱與hIgG的結(jié)合力有限，也可能是部分亞型hIgG與Protein G蛋白柱結(jié)合力較弱導(dǎo)致[36-37]。盡管制備過程伴隨著部分損失，但通過該方法能夠獲得比天然IgG唾液酸化程度更高的IgG。

3 結(jié) 論

本研究采用體外糖基化方法制備唾液酸化hIgG，首先使用優(yōu)化的神經(jīng)氨酸酶水解條件將bIgG的Neu5Gc殘基酶解，避免了這種非人源唾液酸形式的潛在危害，然后利用B4GALT1和ST6GAL1這2 種糖基轉(zhuǎn)移酶將半乳糖和Neu5Ac轉(zhuǎn)移至bIgG，并經(jīng)過對木瓜蛋白酶酶解hIgG條件的優(yōu)化與選擇，制備體外糖基化hIgG的Fc片段。結(jié)果表明，制備的hIgG分子增加了8.4個半乳糖殘基和42個Neu5Ac殘基，在10 mg/mL hIgG、m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）＝0.05、10 mmol/L半胱氨酸溶液、2 mmol/L EDTA溶液、pH 7.0條件下酶解3 h可制得較高純度的hIgG Fc片段，最終hIgG得率為71.7%，F(xiàn)c片段得率為20.8%。本研究為避免動物源食品的潛在風(fēng)險開啟了新思路，為研究體外糖基化IgG及其Fc片段的生物活性提供了基礎(chǔ)，有助于動物源食品人源化產(chǎn)品的開發(fā)利用和動物源產(chǎn)品的營養(yǎng)價值評價。