宋 文，張 琴，寧 明，周發(fā)科，楊新泉，單春會(huì)，唐鳳仙

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000）

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus）屬于葫蘆科黃瓜屬甜瓜亞屬的一個(gè)品種，得名于清代康熙年間，古稱 “甘瓜”、“甜瓜”，維吾爾語稱“庫拱”[1-2]。新疆栽培哈密瓜已有4 000多年的歷史，不僅是我國甜瓜栽培歷史最悠久、種植面積最大、品種資源最豐富、品質(zhì)最佳的地區(qū)，也是世界甜瓜種植基地之一，其在吐哈盆地獨(dú)特的地理、生態(tài)條件下，通過世代相傳的特殊栽培技術(shù)，形成了哈密瓜特有的品質(zhì)[2]。新疆哈密瓜不僅美味可口，而且營養(yǎng)豐富，富含糖分、果膠物質(zhì)、纖維素、蘋果酸、維生素以及鈣、磷、鐵等元素，適宜于腎病、胃病、咳嗽痰喘、貧血和便秘患者。作為我國新疆地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，哈密瓜對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展起重要作用。由于新疆地域遼闊、交通運(yùn)輸不便，因此低溫貯藏是使用廣泛的果蔬保鮮方式之一[3]。然而長時(shí)間的低溫貯藏會(huì)導(dǎo)致哈密瓜發(fā)生冷害，加快哈密瓜表皮的凹陷、褐變以及腐爛，從而影響經(jīng)濟(jì)效益[4]。因此從分子生物學(xué)角度研究哈密瓜的耐冷機(jī)制對(duì)提高哈密瓜耐冷性具有重要意義。

冷脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因素之一，會(huì)刺激植物在體內(nèi)產(chǎn)生并積累活性氧、丙二醛、過氧化氫等有毒物質(zhì)，破壞細(xì)胞質(zhì)膜，引起細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，最后導(dǎo)致細(xì)胞與組織的死亡，從而影響植物的生長[5-6]。植物在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一系列復(fù)雜的保護(hù)機(jī)制適應(yīng)環(huán)境脅迫對(duì)其產(chǎn)生的影響，其中谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）抗氧化系統(tǒng)屬于植物體內(nèi)氧自由基清除體系的主要防御措施之一[7]。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）是一種多功能酶，可以催化GSH和疏水及親電底物的共價(jià)結(jié)合，形成共軛物，隔離在液泡或轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體，從而對(duì)內(nèi)源和外來有害物質(zhì)進(jìn)行降解，以達(dá)到降低細(xì)胞損害程度的作用[8-9]。典型的GST蛋白含有兩個(gè)功能位點(diǎn)：一個(gè)是N-末端結(jié)構(gòu)域中的GSH結(jié)合位點(diǎn)（G-位點(diǎn)），另一個(gè)是C-末端共底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（H-位點(diǎn)）[10]。通常GST被分為7 類，包括Tau（GSTU）、Phi（GSTF）、Lambda（GSTL）、Theta（GSTT）、Zeta（GSTZ）、四氯氫醌脫鹵素酶（tetrachlorohydroquinone dehalogenase，TCHQD）和脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）[11]。作為植物特有的一類GST，DHAR可將GSH作為還原劑，催化脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）還原為抗壞血酸（ascorbic acid，AsA），從而保護(hù)植物組織免受活性氧的損害[12]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，與不耐冷型哈密瓜相比，耐冷型哈密瓜GST相關(guān)差異蛋白在冷脅迫初期顯著上調(diào)表達(dá)[3]。本研究在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上對(duì)哈密瓜DHAR基因（CmDHAR）進(jìn)行鑒定分析，隨后利用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）技術(shù)分析冷脅迫下的基因表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步揭示DHAR基因在哈密瓜抵御冷脅迫過程中參與的反應(yīng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐冷型哈密瓜“伽師瓜-310”（JS）與不耐冷型哈密瓜“金皇后-308”（GE）果實(shí)，2019年7—9月采購自新疆石河子121團(tuán)農(nóng)場。樣品成熟度為八成熟、大小均勻、無機(jī)械損傷及病蟲害。采后套泡沫網(wǎng)套直接置于（0.5±0.5）℃冷庫中貯藏0、6、12、18、24 d，從果實(shí)赤道周圍3個(gè)位置的外表皮內(nèi)層1～2 mm處采集果肉1.2～1.5 g并立即用液氮冷凍，隨后保藏于-80 ℃超低溫冰箱。每個(gè)品種每次實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)果實(shí)，進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

Plant DHAR ELISA檢測試劑盒、Plant AsA ELISA檢測試劑盒 上海優(yōu)選生物科技有限公司；UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WD-2102A多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳儀器有限公司；ZXRD-7080恒溫鼓風(fēng)干燥箱 河北潤創(chuàng)科技開發(fā)有限公司；LightCycler480 II型熒光定量PCR儀瑞士Rotkreuz公司；FA201S萬分之一分析天平 上海天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1CmDHAR基因生物信息學(xué)分析

從哈密瓜數(shù)據(jù)庫Cucurbit Genomics Database（http://cucurbitgenomics.org）中獲取哈密瓜（Melon（DHL92）genome 3.5.1）的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)文件。從擬南芥（Arabidopsis thaliana）數(shù)據(jù)庫TAIR（https://www.arabidopsis.org）獲取擬南芥DHAR（AtDHAR）的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)文件。從EnsemblPlants（http://plants.ensembl.org/index.html）獲取水稻（Oryza sativa Japonica）DHAR（OsDHAR）的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)文件。隨后通過與擬南芥和水稻DHAR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)、篩選，鑒定得到了哈密瓜的DHAR基因。

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的Protein BLAST工具鑒定篩選獲得CmDHAR的可靠性。利用在線工具CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）鑒定CmDHAR基因的保守功能域；利用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)CmDHAR成員編碼蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸長度進(jìn)行分析；使用Softberry（www.softberry.com）對(duì)CmDHAR成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位；使用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行多序列比對(duì)分析；使用MEGA7軟件，采用鄰比法（Neighborjoining，NJ）構(gòu)建物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用MCScanX和TBTools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）完成共線性分析[13]；使用MEME（http://meme-suite.org）對(duì)CmDHAR功能基序進(jìn)行分析；使用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)CmDHAR順式作用元件進(jìn)行預(yù)測；使用STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）對(duì)CmDHAR與哈密瓜其他GST家族蛋白之間的相互作用進(jìn)行分析；SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）用于對(duì)CmDHAR的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟件對(duì)CmDHAR進(jìn)行分析[14]。

1.3.2 CmDHAR活力及AsA含量測定

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔后按照ELISA檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，在450 nm波長下使用酶標(biāo)儀測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品CmDHAR活力及AsA含量。

1.3.3 哈密瓜總RNA提取

采用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒分別從哈密瓜表皮內(nèi)層1～2 mm處的果肉提取總RNA。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 Real-time RT-PCR序列Table 1 List of primer sequences used for real-time RT-PCR

1.3.4CmDHAR基因的real-time RT-PCR驗(yàn)證

以GAPDH（LOC103484230）為內(nèi)參基因，選取CmDHAR基因，通過real-time RT-PCR對(duì)其在冷脅迫下的基因表達(dá)水平進(jìn)行測定。利用SYBRGreen染料法在ABI2700系統(tǒng)上開展real-time RT-PCR檢測。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s；60 ℃退火30 s，65 ℃延伸25 s（40 個(gè)循環(huán)），進(jìn)行3 組生物學(xué)重復(fù)，基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016、SPSS 19.0和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmDHAR基因的基本信息

將篩選獲得的2個(gè)CmDHAR基因，根據(jù)GST系統(tǒng)命名法分別命名為CmDHAR1（MELO3C020204T1）與CmDHAR2（MELO3C023826T1）。由表2可知，2個(gè)CmDHAR基因編碼蛋白氨基酸的長度分別為CmDHAR1（297 aa）與CmDHAR2（206 aa），等電點(diǎn)分別為CmDHAR1（8.67）與CmDHAR2（5.99），分子質(zhì)量分別為CmDHAR1（33 082.9 Da）與CmDHAR2（22 891.6 Da）。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，2個(gè)CmDHAR基因主要位于葉綠體中。染色體定位顯示CmDHAR1位于哈密瓜6號(hào)染色體，CmDHAR2位于哈密瓜10號(hào)染色體。此外，CD-search結(jié)果表明，2個(gè)哈密瓜CmDHAR均包含可以結(jié)合GSH的GST-N末端功能結(jié)構(gòu)域（CmDHAR1：1～297；CmDHAR2：3～203）。

表2 哈密瓜及其他物種DHAR基因基本信息Table 2 Physicochemical properties of DHAR genes in Hami melon and other species

2.2 CmDHAR系統(tǒng)進(jìn)化與多序列比對(duì)分析

基于NJ構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，CmDHAR1與Q8LE52AtDHAR2為直系同源基因；CmDHAR2與Q9FWR4AtDHAR1為直系同源基因。結(jié)果表明，相比于OsDHAR，CmDHAR與AtDHAR之間的同源性更高（圖1）。

圖1 CmDHAR的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of CmDHAR

基于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，將CmDHAR的氨基酸序列與AtDHAR和OsDHAR的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。圖2表明，CmDHAR基因與AtDHAR和OsDHAR基因之間的氨基酸序列保守性較高，說明CmDHAR與AtDHAR和OsDHAR在抵御脅迫過程中具有類似的功能[15-16]。此外，在CmDHAR的蛋白中還找到了12個(gè)GSH結(jié)合位點(diǎn)（G-site）與9 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

圖2 哈密瓜與其他DHAR的蛋白氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 2 Multiple sequence alignments of DHAR from Hami melon and other species

2.3 CmDHAR基因結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知，CmDHAR基因包含6個(gè)外顯子與6個(gè)保守基序，這與Q8LE52AtDHAR2和水稻DHAR的基因結(jié)構(gòu)相似，再次證明DHAR基因的高度保守性，說明它們?cè)诠δ苌暇哂幸欢ǖ南嗨菩訹17]。除了CmDHAR2，其他DHAR均包含motif 5，表明在進(jìn)化過程中CmDHAR2缺失了這段氨基酸序列，也說明CmDHAR在進(jìn)化過程中會(huì)存在一定的差異[18]。

圖3 哈密瓜與其他植物DHAR的基因結(jié)構(gòu)（A）與功能基序（B）預(yù)測Fig. 3 Gene structure (A) and motif (B) prediction of DHAR in Hami melon and other plants

PlantCare預(yù)測結(jié)果表明CmDHAR基因包含10 種順式作用元件（表3），它們可以分為3 大類：脅迫相關(guān)作用元件（WUN-motif、MBS與W box）、植物激素作用元件（TCA-element、TGA-element、TGACG-motif與CGTCA-motif）及光反應(yīng)作用元件（GT1-motif、I-box與MRE）[19-20]。CmDHAR1包括TGA-element、TGACG-motif、CGTCA-motif等植物激素作用元件與光反應(yīng)作用元件GT1-motif和MRE。有研究表明植物激素、光合作用等在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抵御脅迫方面起到關(guān)鍵作用[5,21]。CmDHAR2包括脅迫相關(guān)作用元件WUN-motif、MBS和W box，植物激素作用元件TCA-element及光反應(yīng)作用元件I-box。其中WUN-motif作用元件與抵御冷脅迫相關(guān)[22]，MBS作用元件是抗逆因子MYB的結(jié)合位點(diǎn)[23]。綜上所述，推測CmDHAR在抵御脅迫方面發(fā)揮著重要作用。

表3 哈密瓜CmDHAR基因順式作用元件Table 3 Cis-elements of CmDHAR genes in Hami melon

2.4 CmDHAR共線性分析

為進(jìn)一步了解DHAR的進(jìn)化關(guān)系，利用MCScanX和TBtools軟件對(duì)葫蘆科植物的DHAR基因進(jìn)行共線性分析。圖4說明CmDHAR基因與其他葫蘆科植物中的DHAR基因之間存在明顯的共線性關(guān)系。哈密瓜與西瓜存在1 對(duì)同源基因?qū)?，與黃瓜存在2 對(duì)同源基因?qū)?，與西葫蘆、筍瓜和南瓜之間各存在3 對(duì)同源基因?qū)Γf明在物種進(jìn)化過程中，哈密瓜與西葫蘆、筍瓜和南瓜更為接近。此外，CmDHAR2與其他5個(gè)物種至少存在1 對(duì)同源基因?qū)?，推測CmDHAR2在這6個(gè)物種分化前已經(jīng)存在，也證明CmDHAR2在進(jìn)化過程中十分重要。

圖4 哈密瓜與其他物種DHAR的共線性分析Fig. 4 Synteny analysis of DHAR from Hami melon and other species

非同義突變頻率（Ka）與同義突變頻率（Ks）的比值結(jié)果表明，8 對(duì)同源基因?qū)Φ腒a/Ks＜1，說明它們?cè)谶M(jìn)化過程中發(fā)生了純化選擇，避免了對(duì)自身不利的變異（表4）[24-25]?；虮对鰰r(shí)間估算結(jié)果表明，這8 對(duì)同源基因?qū)Ρ对龅臅r(shí)間大約發(fā)生在0.65～3.5百萬年前。

表4 哈密瓜及其他物種DHAR基因復(fù)制分析Table 4 Duplication analysis of DHAR genes in Hami melon and other species

2.5 CmDHAR的蛋白互作分析

蛋白質(zhì)之間通過相互作用在生物體內(nèi)行使其相應(yīng)的生物學(xué)功能[26]。蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果表明（圖5），CmDHAR成員與其他哈密瓜GST成員之間相互作用效果明顯。因此推測，在響應(yīng)脅迫過程中，DHAR可以有效調(diào)節(jié)其他家族蛋白共同發(fā)揮作用，參與一系列生化反應(yīng)幫助哈密瓜抵御脅迫。CmDHAR與其他哈密瓜GST家族蛋白的具體互作機(jī)制將在日后進(jìn)行深入研究。

圖5 CmDHAR及其他GST家族蛋白之間互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Protein-protein interaction networks of CmDHAR with other CmGST members in Hami melon

2.6 CmDHAR三級(jí)模型的預(yù)測

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明CmDHAR主要包括α-螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角4 種構(gòu)象，其中在CmDHAR1中：α-螺旋（43.10%）、無規(guī)卷曲（42.76%）、延伸鏈（10.44%）和β-轉(zhuǎn)角（3.70%）；在CmDHAR2中：α-螺旋（45.63%）、無規(guī)卷曲（38.83%）、延伸鏈（9.71%）與β-轉(zhuǎn)角（5.83%）。

基于同源建模法，在SWISS-MODEL中以毛果楊DHAR（ID：5mye.1.A；5n9u.1.A）為模板[27]，分別預(yù)測了CmDHAR1與CmDHAR2的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，其中CmDHAR2與5n9u.1.A的序列相似性為73.53%，GMQE為0.80，QMEAN為-2.69，說明模板能較好地?cái)M合CmDHAR2的三維結(jié)構(gòu)[28]。ProQ三級(jí)模型質(zhì)量評(píng)估結(jié)果表明CmDHAR2的LGscore為4.375，MaxSub為0.366，證明模型預(yù)測的可靠性較高[29]。圖6表明，CmDHAR2蛋白主要由α-螺旋（紫色）、無規(guī)卷曲（白色）、延伸鏈（黃色）和β-轉(zhuǎn)角（青色）構(gòu)成。在CmDHAR2蛋白中找到了12個(gè)GST-N末端功能結(jié)構(gòu)域的GSH結(jié)合位點(diǎn)（G-site），包括20C、22F、25R、44L、47K、58G、59K、60V、61P、72D、73S與202K。其中，20C、22F、25R、72D和73S 位于α-螺旋；58G、59K 與202K位于無規(guī)卷曲；60V與61P 位于延伸鏈；44L與47K位于β-轉(zhuǎn)角。22F參與疏水互作；25R、60V、61P、72D與73S構(gòu)成氫鍵；47K構(gòu)成鹽橋。這12個(gè)G-sites均位于CmDHAR2蛋白的表面，有利于CmDHAR2與GSH的結(jié)合[19]。

圖6 CmDHAR2蛋白質(zhì)三級(jí)模型預(yù)測Fig. 6 Deduced 3D structure of CmDHAR2

2.7 CmDHAR基因響應(yīng)冷脅迫的表達(dá)分析

由圖7可知，低溫貯藏對(duì)GE的影響更大。在冷藏第12天時(shí)，GE表皮開始出現(xiàn)褐變并產(chǎn)生凹陷，隨著貯藏時(shí)間的延長，GE的冷害程度越來越嚴(yán)重。相比于GE，JS在第18天表皮開始產(chǎn)生凹陷，受冷害影響的程度較小。由此可知，在響應(yīng)低溫脅迫時(shí)，JS與GE內(nèi)部抵御氧化脅迫體系的差異性決定了它們?cè)谫A藏過程中品質(zhì)變化的差異性。

圖7 低溫貯藏過程中哈密瓜外觀狀態(tài)Fig. 7 Appearance of Hemi melon fruits after cold storage

DHAR與AsA循環(huán)系統(tǒng)在植物抵御氧化脅迫過程中具有重要作用[30]。從圖8可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，耐冷型JS和不耐冷型GE果實(shí)中CmDHAR活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在0～12 d，JS中的CmDHAR活力均高于GE，且在第12天時(shí)差異極顯著（P＜0.01），隨后酶活力逐漸降低。在GE中，CmDHAR活力在第18天達(dá)到最高值，隨后活力下降（圖8）。AsA含量隨貯藏時(shí)間延長逐漸降低，但其在JS中的含量高于GE，說明在響應(yīng)低溫脅迫過程中，AsA扮演著重要角色[31]。結(jié)果表明，CmDHAR活力快速、高水平的表達(dá)有利于提升哈密瓜對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，從而降低冷害的損傷，能夠較好地維持哈密瓜的商品價(jià)值[32]。

圖8 低溫貯藏過程中CmDHAR活力和AsA含量的變化Fig. 8 Effect of cold storage on CmDHAR activity and AsA content in Hemi melon

利用real-time RT-PCR驗(yàn)證哈密瓜CmDHAR1與CmDHAR2基因在冷脅迫下的表達(dá)情況（圖9）。隨著貯藏時(shí)間的延長，CmDHAR1和CmDHAR2均為上調(diào)表達(dá)。與GE相比，CmDHAR1與CmDHAR2在JS中的相對(duì)表達(dá)量更高，說明CmDHAR基因在響應(yīng)冷脅迫過程中的重要性，它的大量表達(dá)可以延緩冷害發(fā)生[33]。

圖9 低溫貯藏過程中CmDHAR基因表達(dá)的變化Fig. 9 Effect of cold storage on the expression levels of CmDHAR genes

2.8 CmDHAR GSEA

基于基因表達(dá)結(jié)果，使用GSEA對(duì)CmDHAR進(jìn)行功能注釋，結(jié)果表明CmDHAR的高表達(dá)與結(jié)構(gòu)分子活性、大分子復(fù)合物、細(xì)胞膜封閉內(nèi)腔以及抗氧化活性等生物學(xué)功能顯著關(guān)聯(lián)（圖10）。GSEA結(jié)果說明在冷脅迫下，CmDHAR可以通過參與上述生物學(xué)過程調(diào)節(jié)生化反應(yīng)，從而響應(yīng)冷脅迫。

圖10 CmDHAR 基因GSEA功能富集結(jié)果Fig. 10 GSEA analysis of CmDHAR genes

3 討 論

DHAR屬于GST中的一類抗氧化酶，具有谷胱甘肽依賴性硫醇轉(zhuǎn)移酶和DHAR活性，是AsA循環(huán)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，參與氧化還原穩(wěn)態(tài)，可以清除氧化應(yīng)激下產(chǎn)生的活性氧自由基[34-35]。Noshi等[36]研究發(fā)現(xiàn)AtDHAR1在擬南芥抵御光氧化脅迫中起關(guān)鍵作用。Dixon等[35]認(rèn)為AtDHAR參與氧化還原反應(yīng)，并且在清除活性氧自由基過程中發(fā)揮重要作用。Ushimaru等[37]將水稻中OsDHAR1基因提取并在擬南芥中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生品種（空白對(duì)照組）相比，導(dǎo)入OsDHAR1基因的擬南芥耐鹽性有所提高。Yin Guangkun等[38]研究發(fā)現(xiàn)OsDHAR1活力的下降會(huì)導(dǎo)致水稻更容易受到活性氧的損害。Loi等[30]對(duì)馬鈴薯進(jìn)行外源施加霉菌毒素處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明處理組的DHAR、DHA及GSH含量有所提升，表明馬鈴薯DHAR在參與響應(yīng)氧化脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。

本研究對(duì)2個(gè)CmDHAR基因進(jìn)行鑒定并研究了冷脅迫下的酶活力及基因表達(dá)水平，確定了CmDHAR基因在響應(yīng)冷脅迫過程中扮演重要角色。根據(jù)CmDHAR在染色體的分布位置將其分別命名為CmDHAR1和CmDHAR2。CmDHAR1位于哈密瓜6號(hào)染色體，CmDHAR2位于哈密瓜10號(hào)染色體。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明CmDHAR基因與AtDHAR基因的同源性更高。多序列比對(duì)結(jié)果表明CmDHAR基因的GST-N末端功能結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中序列保守性較高，因此更有利于G-site與GSH的結(jié)合[39-40]。CmDHAR基因與擬南芥和水稻中參與抗氧化過程的DHAR基因的氨基酸序列保守性較高，說明CmDHAR基因在抵御脅迫過程中具有相似的功能?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明CmDHAR包含6個(gè)外顯子、6個(gè)保守基序、3大類順式作用元件，由于結(jié)構(gòu)上是保守的，再次證明CmDHAR與擬南芥和水稻DHAR具有相似的功能[15-16]。共線性分析說明在葫蘆科植物中，哈密瓜與西葫蘆、筍瓜和南瓜在物種進(jìn)化過程中更為接近，同源基因?qū)Ρ对龅臅r(shí)間大約發(fā)生在0.65～3.5百萬年前。蛋白互作分析表明CmDHAR成員與其他哈密瓜GST成員之間聯(lián)系緊密，說明CmDHAR在調(diào)節(jié)各類蛋白共同發(fā)揮作用方面發(fā)揮重要作用[23,41]。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明CmDHAR2主要由α-螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)構(gòu)成。鑒定到的12個(gè)GSH結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)表面，這在結(jié)構(gòu)上更有助于CmDHAR2與GSH的結(jié)合。冷脅迫下，耐冷型JS中的CmDHAR活力、AsA含量及CmDHAR基因表達(dá)量明顯高于不耐冷型GE。GSEA功能富集分析顯示CmDHAR通過參與一系列生物學(xué)過程響應(yīng)冷脅迫，表明其在哈密瓜響應(yīng)冷脅迫的機(jī)制中十分重要。未來將會(huì)對(duì)CmDHAR基因在冷脅迫過程中的具體代謝及調(diào)控機(jī)制做進(jìn)一步研究。