王新惠，潘 攀，孫勁松，丁 悅，劉力嘉，張雅琳，肖龍泉，田 甜，劉 洋,*

（1.成都大學食品與生物工程學院，肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都 610106；2.宜賓學院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.成都農業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 611130）

漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）有代謝乳糖、乳酸鹽和蛋白質的能力，且代謝可產生香味，常應用于肉制品發(fā)酵、干酪發(fā)酵、泡菜發(fā)酵以及果蔬病害拮抗等方面。一系列特性使得漢遜德巴利酵母應用研究涉及到食品加工、食品儲藏、食品安全以及醫(yī)藥健康[1-7]。

漢遜德巴利酵母在發(fā)酵過程中不僅可以通過代謝糖、蛋白質等物質產生需要的風味物質以及利于人體消化的小分子物質[3]，同時也會產生一些有毒有害的物質，如生物胺[8]。生物胺是一種非揮發(fā)性的含氮有機堿，食品中生物胺含量和種類各有異同，主要有組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺和亞精胺，其中毒性較強和關注度較高的是組胺和酪胺，生物胺攝入后會刺激神經和血管，具有一定致癌性，組胺口服量達到8 mg便可能對機體產生輕微中毒癥狀[9-10]。食品中生物胺除在食品生產原輔料中含有少量外，主要通過微生物脫羧形成。在適宜的生長環(huán)境下，漢遜德巴利酵母通過分泌特定氨基酸脫羧酶作用于對應的前體氨基酸發(fā)生脫羧反應而生成相應的生物胺，究其原因，是漢遜德巴利酵母對含氮化合物利用不充分，而導致生物胺在機體內積累。當環(huán)境中存在多種氮源時，微生物會優(yōu)先利用豐富型氮源，而被抑制貧乏型氮源利用，這種現象被稱為氮代謝阻遏效應，這類全局調控的研究，對降低甚至消除生物胺等有害物質具有重要意義[11]。

目前，對微生物發(fā)酵劑研究主要集中在菌種分離鑒定、發(fā)酵劑配比和特性研究，對安全性研究主要集中在有毒有害物質含量檢測和安全控制，組胺等有毒有害物質背后具體產生機理仍然不夠清晰明了[7,12-14]。新一代測序技術已經成為各學科研究的應用重點之一[15]，轉錄組測序通過快速獲得某物種特定狀態(tài)全部轉錄本，再進行新轉錄本預測和差異分析，具有較好的應用前景[16-17]。本研究通過添加組胺產生的前體物質L-組氨酸進行刺激培養(yǎng)，探索漢遜德巴利酵母氨基酸調控過程，旨在為進一步闡明組胺代謝機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

漢遜德巴利酵母菌株：課題組實驗室保存，分離篩選于香腸。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[18]：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，補水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：添加20 g/L瓊脂粉于液體YPD液體培養(yǎng)基內，121 ℃滅菌20 min。

L-組氨酸培養(yǎng)基：添加不同比例L-組氨酸于已滅菌YPD液體培養(yǎng)基內，配制成質量分數為0.1%、0.5%、0.8%組氨酸培養(yǎng)基，并以不添加L-組氨酸的培養(yǎng)基作為空白。

1.1.2 試劑

L-組氨酸 美國 Sigma公司；蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖（均為分析純） 成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

RC-I-20L超純水機 成都瑞昌儀器制造有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；JA3103N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；721可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化培養(yǎng)

菌株劃線培養(yǎng)于YPD固體培養(yǎng)基，穩(wěn)定生長后取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，取對數期菌液劃線培養(yǎng)于YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)待用。

1.3.2L-組氨酸刺激培養(yǎng)

已滅菌YPD液體培養(yǎng)基中添加不同比例的L-組氨酸，配制成質量分數為0.1%、0.5%、0.8%組氨酸培養(yǎng)基，并以不添加L-組氨酸的培養(yǎng)基作為空白，30 ℃進行培養(yǎng)，每隔8 h取樣一次。

1.3.3 OD值測定

以空白培養(yǎng)基作為對照，600 nm波長下，1 cm比色皿測定菌液OD值，平行測定3 次，對培養(yǎng)后期菌液進行稀釋測定。

1.3.4 組胺含量測定

參照王新惠等[18]的方法對菌液中組胺含量進行測定。

1.3.5 轉錄組測序樣品制備

將活化后的漢遜德巴利酵母菌株接種于YPD固體平板，穩(wěn)定生長后，挑取單個菌種，無菌水稀釋，取100 μL稀釋液轉接至YPD液體培養(yǎng)基，添加L-組氨酸作為實驗組，設置空白對照，30 ℃振蕩培養(yǎng)，各取樣1 mL，液氮速凍，立即置于-80 ℃，后續(xù)用于轉錄組測序。

1.3.6 轉錄組測序樣品處理

提取樣品total RNA后使用DNaseI消化DNA，并對RNA樣品進行檢測[19]。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測提取質量，檢查RNA的完整性，指標包括RNA完整值、片段大小、RNA濃度和28S與18S核糖體RNA比值。再使用紫外分光光度計NanoDrop檢測RNA純度（OD260nm/OD280nm）。檢測結果達到要求后再進行文庫建立。

1.3.7 轉錄組測序文庫建立

RNA的完整性和純度檢測結果滿足標準后，進行mRNA富集，富集完成后加入破碎緩沖液將其充分破碎；接著進行首條互補DNA的模板合成，再加入配合物合成非模板DNA鏈，并使用試劑盒對合成的互補DNA進行純化；互補DNA純化完成后末端修復、加A尾、連接測序接頭，并依據聚合酶鏈式反應進行擴增。

1.3.8 轉錄組測序文庫檢測

擴增完成后，文庫制備完成，接著利用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測建庫中片段范圍，利用ABI StepOnePlus實時聚合酶鏈式反應系統(tǒng)定量建庫濃度。建庫片段范圍和濃度達到要求后，利用Illumina HiSeq儀器實行轉錄組測序。

1.3.9 轉錄組測序數據處理與分析

將測序結果所得原始數據進行篩選，并將篩選后數據進行參考序列比對。比對后實行表達量分析，并對比各組差異表達情況，進行基因本體論（Gene Ontology，GO）、Pathway和聚類分析等功能分析。

1.3.9.1 質量控制

對結果數據中質量較低、接頭污染和為止堿基數量過高數據進行去除，去除后進行質量評估，質量評估主要包括數據量統(tǒng)計、堿基含量分布統(tǒng)計、堿基質量分布統(tǒng)計。

1.3.9.2 基因表達水平分析

采用生信軟件Bowtie2將篩選后數據進行參考比對，再對轉錄本和基因表達水平進行計算。使用R軟件進行相關性分析和聚類分析[20-21]。

1.3.9.3 差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）分析

基因表達具有空間和時間特異性，在差異實驗中表達水平對比產生顯著差異的基因稱為DEG。DEG檢測使用PossionDis算法，|log2Fold Change|＞1，同時q-value＜0.001作為DEG篩選閾值，篩選完后使用R軟件進行后續(xù)分析。

1.3.9.4 DEG功能富集分析

GO注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋完成后，參考官方生物通路分類，對DEG及其對應的生物通路進行分類分析。對得到的P值進行校正，并使用R軟件中的phyper函數進行系列富集分析（蛋白容錯率≤0.01）[22-25]。

2 結果與分析

2.1 L-組氨酸對漢遜德巴利酵母生長代謝的影響

2.1.1L-組氨酸添加量對漢遜德巴利酵母生長的影響

在適宜生長條件下，漢遜德巴利酵母通過分泌組氨酸脫羧酶作用于環(huán)境中組氨酸而產生組胺，因此組氨酸含量對可能漢遜德巴利酵母繁殖和代謝有很大影響。由圖1可以看出，L-組氨酸刺激后各組間OD值無較大差異，均在32 h后進入快速生長期，48 h后生長繁殖速度下降。0.5%L-組氨酸刺激培養(yǎng)后，在48 h后生長速率高于其他實驗組，且培養(yǎng)后期OD值略大于其他組；0.8%L-組氨酸組刺激培養(yǎng)前期生長速率較快，發(fā)酵后期OD值小于其他組。

圖1 不同用量L-組氨酸刺激后菌液OD值變化Fig. 1 Changes in cell density, expressed as optical OD at 600 nm during culture in the presence of different concentrations of L-histamine

2.1.2L-組氨酸添加量對漢遜德巴利酵母組胺生成的影響

組胺大量生成需要3個條件：1）具有能夠產生組氨酸脫羧酶的微生物；2）體系中含有游離組氨酸；3）適宜的生長繁殖環(huán)境。前體物質組氨酸作為產胺必要條件之一，對微生物代謝和體系中組胺含量有很大的影響。由圖2可以看出，添加L-組氨酸對組胺生成具有促進作用，刺激培養(yǎng)8～24 h組胺開始積累，各組間無較大差異；24 h后各組出現差異并且生成速率增大，40 h后組胺生成速率降低。0.1%L-組氨酸和0.3%L-組氨酸刺激后組胺積累量比空白組略高，0.5%L-組氨酸和0.8%L-組氨酸積累量相比空白組較高。由于0.5%L-組氨酸和0.8%L-組氨酸無較大差異，選擇0.5%L-組氨酸作為刺激培養(yǎng)條件；鑒于產物合成比基因表達滯后，結合生長代謝情況，確定接種后36 h作為取樣時間。

圖2 不同用量L-組氨酸刺激后組胺積累量變化Fig. 2 Changes in histamine contents during culture in the presence of different concentrations of L-histamine

2.2 轉錄組測序數據質量分析

對過濾得到的數據進行統(tǒng)計，結果如表1所示，對照組的測序結果共得到42.921 6 M clean reads，實驗組的測序結果共得到41.415 4 M clean reads。0.5%L-組氨酸作實驗組，其與空白對照組Q20大于95%，Q30大于87%，GC含量大于40%。結果表明測序數據質量符合要求。

表1 過濾后的reads數據量及質量統(tǒng)計Table 1 Statistics of the amount and quality of filtered reads

2.3 表達水平分析

轉錄本豐度是體現基因表達水平的重要指標，通常豐度越高表達水平越高。轉錄組測序分析則可以定位基因組區(qū)域或外顯子區(qū)的reads，并且體現其表達水平，同時基因測序深度、基因長度均和表達水平呈現正相關趨勢。為闡述其具體表達水平和對比情況，引入FPKM術語，FPKM是指每百萬片段中每千堿基長度的片段數目。

如圖3所示，當lg（FPKM+1）值小于1.8時，實驗組基因密度略高，lg（FPKM+1）值大于1.8后，對照組基因密度略高。小提琴圖是箱線圖和密度圖的集合，箱線圖主要體現數據中位數、異常值以及分布區(qū)間等信息；密度圖則主要體現其概率密度。小提琴圖中箱型框表示四分位數范圍，箱型框中間橫線表示中位數，箱型框鏈接線條表示95%置信區(qū)間，箱型框周圍圖形寬度表示密度寬度（頻率）。如圖4所示，實驗組和對照組基因表達水平中位數和分布密度無較大差別，實驗組95%置信區(qū)間略大，兩組樣品分布情況趨勢一致。

圖3 FPKM分布圖Fig. 3 FPKM distribution map

圖4 FPKM小提琴圖Fig. 4 FPKM violin map

2.4 DEG表達分析

2.4.1 差異表達水平

倍數表達圖（MA圖）可展現DEG的分布情況，圖中每個點對應一個基因。兩組樣品基因的表達水平如圖5所示，差異倍數的整體分布較為明顯，較多基因log2Fold Change值較大，說明這些基因的差異變化較為顯著。

圖5 DEG MA圖Fig. 5 MA map of differentially expressed genes

2.4.2 DEG表達情況

設置篩選差異倍數和q-value閾值（|log2Fold Change|＞1同時q-value＜0.001），圖6結果顯示，檢測DEG 133個，其中78個差異表達上調基因，55個差異表達下調基因，上調表達基因數量大于下調表達基因。

圖6 DEG表達情況Fig. 6 Statistics of differentially expressed genes

2.5 DEG功能富集分析

2.5.1 DEG GO功能分析

GO作為基因功能國際標準統(tǒng)一分類體系，常用于基因和蛋白質限定和描述，是基因本體聯(lián)合會創(chuàng)建的數據庫之一。包含生物學過程、分子功能和細胞組分3個分支。由圖7所示，本研究挑選了富集較為顯著的24個條目進行顯示。

圖7 不同處理下DEG GO功能分類Fig. 7 GO functional classification of differentially expressed genes under different treatments

DEG參與的生物學過程包括代謝過程、細胞過程、細胞內定位、應激反應、生物調節(jié)、涉及多細胞有機體的過程、生物學過程調控、生物附著、細胞組分組織或生物合成、生物過程正向調節(jié)、氮利用、信號等過程。其中參與代謝過程DEG最多，說明大多DEG參與了細胞代謝和代謝物轉化；其次參與細胞過程和細胞內定位DEG，說明DEG參與細胞轉運代謝的過程也較多。

DEG參與的細胞組分包括胞膜組分、胞膜、細胞、細胞組分、細胞器、復合蛋白、細胞器組分、膜結合腔體、細胞間區(qū)域等過程。其中胞膜組分和胞膜中包含DEG最多，說明參與物質交換的DEG較多。

DEG參與的分子功能包括催化活性、結合蛋白、轉錄因子活性、抗氧化活性、轉錄調節(jié)活性、分子功能調節(jié)等過程。其中催化活性差異和結合蛋白DEG最多，說明大部分DEG參與了催化反應和特異性結合反應進程。

2.5.2 DEG Pathway功能分析

KEGG包含多個分類數據庫，是一個關于對基因組、化學以及系統(tǒng)功能通信的整合數據庫。KEGG GENES數據庫主要儲存基因組信息；KEGG通路數據庫主要儲存代謝通路信息；KEGG配體數據庫則主要儲存酶分子、酶反應及化學復合物信息，生信分析中對代謝過程、周期因子、跨膜轉運、信號分子等信息研究較多，所以代謝通路數據庫的使用頻率最大，數據庫也較為全面和完善。

功能分析中可以用散點圖形式展現KEGG富集分析結果，可展示多變量平面分布情況。散點圖中，主要通過兩個因素展示富集結果，一個是q-value，指的是校正P-value，一般取值在0～1之間，值越接近1表示富集越不顯著。另一是富集因子，表示代謝通路的DEG富集個數和注釋到此通路基因個數的比值，取值越大表示富集程度越大。

如圖8所示，參考KEGG通路數據分類標準，對第2層通路中DEG數量進行分析，統(tǒng)計DEG在該分類中的個數，并利用散點圖的形式展示兩組樣品KEGG富集分析結果。分類結果顯示，大多DEG集中在代謝過程通路；其次是次生代謝物的合成和硫胺素新陳代謝通路，以及過氧物酶體、半乳糖代謝、α-亞麻酸代謝、脂肪酸降解、鞘脂類代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、黃曲霉毒素生物合成、核黃素的新陳代謝、脂肪酸代謝、果糖和甘露糖代謝、不飽和脂肪酸合成、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、色氨酸代謝等通路均出現差異代謝。差異分布顯示，L-組氨酸刺激后漢遜德巴利酵母出現差異代謝，主要集中在輔酶代謝、能量代謝、其他氨基酸代謝、脂肪代謝等過程。

圖8 DEG KEGG富集散點圖Fig. 8 KEGG enrichment scatter plot of differentially expressed genes

2.6 組胺合成代謝調控分析

2.6.1 氨基酸代謝調控分析

微生物對氮源的吸收利用呈現明顯的偏好性，這種偏好性表現在環(huán)境中存在多種氮源時，微生物對谷氨酰胺等豐富型氮源的優(yōu)先吸收代謝，精氨酸等貧乏型氮源則處于抑制狀態(tài)。氨基酸代謝直接影響氮代謝阻遏效應過程，而氮代謝阻遏效應對生物胺代謝具有很大影響。

L-組氨酸刺激培養(yǎng)后氨基酸代謝、碳代謝和脂肪代謝簡化圖如圖9所示，丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）等代謝呈現差異上調；異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、精氨酸等代謝表現為差異上調和差異下調共同呈現；酪氨酸、苯丙氨酸等呈現差異下調，這種現象可能是氮代謝過程整體調控的結果。果糖、葡萄糖、蔗糖、丙酮酸、α-酮戊二酸等呈現差異上調，表明糖酵解和三羧酸循環(huán)呈現上調趨勢，這可能與碳代謝和氨基酸代謝之間關聯(lián)轉化代謝有關；脂肪代謝中DEG主要集中在在乙酰輔酶A代謝和脂肪氧化調控蛋白代謝，乙酰輔酶A氧化酶（1.3.3.6）呈現差異下調，乙酰輔酶A轉酰酶系表現為差異上調和差異下調共同呈現，這可能是能量代謝引起差異變化。

圖9 氨基酸代謝通路圖Fig. 9 Metabolic pathways of amino acids

添加前體組氨酸后，不僅各類氨基酸呈現差異代謝，碳水化合物和脂肪等代謝也呈現不同方式的差異代謝，說明氮代謝、碳代謝、脂肪代謝是整合關聯(lián)代謝過程，這對組胺代謝調控以及氮代謝阻遏效應分析具有一定參考價值。

2.6.2 組胺合成代謝酶系分析

氨基酸脫羧生成對應的生物胺除了需要游離前體氨基酸和適應的生長環(huán)境外，體系微生物還必須能產生氨基酸脫羧酶。前體氨基酸和生長環(huán)境屬于宏觀可調控條件，對生物體產生的氨基酸脫羧酶的研究顯得十分重要。

組氨酸脫羧酶因組胺具有較強的毒理學作用而備受關注。研究表明，細菌中組氨酸脫羧主要有兩種依賴機制，革蘭氏陽性菌體現為丙酮基依賴，革蘭氏陰性菌則體現為磷酸吡哆醛依賴，丙酮基化合物和磷酸吡哆醛作為必要輔酶因子參與脫羧反應[26]。

如圖10所示，酸性磷酸酶（EC：3.1.3.2）在硫胺素新陳代謝、核黃素代謝以及代謝途徑等通路中出現明顯差異上調，其主要調控酸性硫胺素等物質等物質的生成反應，而磷酸硫胺素是組氨酸脫羧酶進行脫羧反應輔助因子。硫胺素酶（thiaminase，THI）控制硫胺素相關的新陳代謝，THI4、THI5在硫胺素新陳代謝和代謝途徑等通路中出現差異上調，THI5是磷酸吡哆醛代謝關鍵控制酶之一，而磷酸吡哆醛是組氨酸脫羧酶進行脫羧反應關鍵輔酶因子。

圖10 組胺及酶系代謝通路圖Fig. 10 Metabolic pathways of histamine and coenzyme factors

輔助因子和維生素的代謝、跨膜運輸和分解代謝等通路出現差異代謝，說明組氨酸刺激后漢遜德巴利酵母組胺代謝相關的輔酶、氨基酸和胺的轉運代謝等途徑出現差異代謝，雖然組胺代謝直接通路未察看到顯著差異，但組胺調控的關鍵輔酶出現差異變化。

3 結 論

采用Illumina HiSeq測序平臺，對L-組氨酸刺激培養(yǎng)漢遜德巴利酵母的轉錄組進行分析，測序數據質量符合要求，基因表達情況良好。對照組測序結果共得到42.921 6 M clean reads，實驗組測序結果共得到41.415 4 M clean reads。實驗組和對照組差異分析顯示共有133個顯著DEG，其中下調表達基因50 個，上調表達基因78個。GO功能分析表明，代謝過程、細胞過程、細胞內定位、胞膜組分、胞膜差異催化活性差異和結合蛋白等分類DEG較多，說明大多數DEG參與了細胞代謝、細胞轉運、物質交換、催化反應和特異性結合等過程。KEGG富集分析顯示大多DEG集中在代謝途徑通路；其次是次生代謝物生物合成、硫胺素新陳代謝、過氧物酶體等通路。

L-組氨酸刺激培養(yǎng)結果表明，添加組胺前體物質L-組氨酸后，漢遜德巴利酵母在組氨酸代謝通路沒有顯著性差異變化，而在碳水化合物代謝、脂肪代謝、其他氨基酸代謝、輔助因子代謝和轉運代謝等通路出現顯著性差異變化，漢遜德巴利酵母組胺代謝過程可能是通過組氨酸和組胺跨膜運輸相關蛋白和組胺反應輔酶因子（如磷酸吡哆醛和焦磷酸硫胺素）進行控制，或通過谷氨酸和α-酮戊二酸與碳代謝結合協(xié)同調控，具體進程仍需進一步實驗驗證[27-32]。通過添加組胺產生的前體物質L-組氨酸進行脅迫培養(yǎng)，研究結果為闡明漢遜德巴利酵母氨基酸代謝提供思路，為探索漢遜德巴利酵母氮代謝調控和組胺代謝機制過程提供參考依據。