彭 程，肖文熙，倪 輝,3，李利君,3，譚萬森，林燕玲，李清彪,3,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.集美大學港口與環(huán)境工程學院，福建 廈門 361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

新鮮果實經(jīng)過壓榨得到新鮮果汁能較完整地保留水果原有風味、營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性，且口感更好，深受消費者青睞[1]。其中，柑橘汁色澤優(yōu)美、營養(yǎng)豐富、芳香宜人，是世界上最受歡迎、貿(mào)易量最大的果汁產(chǎn)品，大約占據(jù)2/3的世界果汁市場[2]。由于水果中富含大量的果膠、纖維素、半纖維素和淀粉等物質(zhì)，從而造成果汁生產(chǎn)中果漿黏度高、出汁率低、難以澄清等問題，其中果汁澄清困難嚴重影響了果汁飲料的生產(chǎn)[3]。目前，工業(yè)生產(chǎn)中常通過熱處理、冷凍、吸附、膜分離及添加劑等物理化學方法提高果汁飲料澄清度，但這些方法存在成本高、操作復雜、二次污染等不足。相比這些方法，酶法澄清工藝具有操作簡單、反應條件溫和、效率高、營養(yǎng)成分損失少等優(yōu)點[2]。相關(guān)研究表明，果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶等聚糖水解酶對果汁澄清具有顯著效果[4-6]。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化含阿拉伯糖的聚合物中以α-(1,2)、α-(1,3)或α-(1,5)連接的阿拉伯呋喃糖基的水解[7-8]，該酶的主要功能是協(xié)同其他水解酶水解半纖維素等大分子物質(zhì)。在CAZy數(shù)據(jù)庫中，歸屬為GH2、GH3、GH43、GH51、GH54、GH62和GH155家族[9-10]。目前可利用α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶生產(chǎn)具有抗血糖作用的L-阿拉伯糖[11-12]，改善葡萄酒的風味[13-14]，澄清果汁[15]和增強動物飼料的消化[16]；同時該酶還可作為面包的天然改良劑[17]以及應用于紙漿和造紙工業(yè)中[18]。目前，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的優(yōu)良酶資源還不夠豐富，因此，挖掘該酶資源是當前熱點研究領(lǐng)域。

曲霉屬真菌是重要的碳水化合物活性酶來源，具有高分泌蛋白能力[19-20]。此外，黑曲霉（Aspergillus niger）作為公認為安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）的微生物被廣泛用作食品行業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株[21]。本實驗室前期對察氏培養(yǎng)基、柚皮粉培養(yǎng)基以及茶梗培養(yǎng)基發(fā)酵制備的黑曲霉胞外酶液進行差異定量蛋白組學分析，得到差異蛋白α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因序列。對該α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶進行生物信息學分析，并將其異源表達、純化，探究此重組酶的酶學性質(zhì)及在柑橘果汁澄清中的應用潛力，以期為探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的其他應用提供材料和參考，同時也豐富α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料、菌株與質(zhì)粒

柚子購自福建廈門大潤發(fā)超市。

Escherichia coliDH5α、Pichia pastorisSMD1168、含pPIC9K載體的E. coliDH5α均由實驗室保藏；含目的基因α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（AB）pUC57-AB-Kan質(zhì)粒的E. coliDH5α購自金唯智生物科技（蘇州）有限公司。

1.1.2 試劑

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、TaqDNA聚合酶、高效感受態(tài)細胞制備試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NotI、限制性內(nèi)切酶AvrII TaKaRa（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶PmeI New England Biolabs公司；Easy II Protein Quantitative Kit、EasyTaqMix北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside，pNPA） 上海源葉生物有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）、對硝基苯基-β-D-木吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX）、對硝基苯基-α-D-甘露糖苷（p-nitrophenyl-α-D-mannoside，pNPM） 美國Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Biometra T Advanced基因擴增儀 德國耶拿有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；FE20 pH計 瑞士Mettler Toledo公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Centrifuge 5417R小型高速冷凍離心機 德國Eppendorf有限公司；K10金屬浴 杭州奧盛有限公司；GEAI 600凝膠成像儀 美國GE公司；1652100電穿孔儀 美國Bio-Rad公司；Avanti J-26S XP立式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；Epoch 2T酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；YXQ-LS-30SH立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1AB基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建

利用SignalP 4.0 Server在線軟件分析AB基因序列，獲得信號肽位置，并在后續(xù)構(gòu)建重組質(zhì)粒時去除信號肽。DNAMAN軟件對基因序列進行分析，選擇合適的酶切位點AvrII和NotI，并設(shè)計引物（AB-F：CGCCCTAGGGTTTCCTTGAAGGTTTCCAC；AB-R：ATTTGCGGCCGCGTTCGCTGCCAGGACAG），劃線部分為酶切位點。引物和DNA測序均由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

以pUC57-AB-Kan重組質(zhì)粒為模板，在PrimeSTAR HS DNA Polymerase的作用下，以AB-F和AB-R為引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸2.5 min，進行30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃，保存。反應結(jié)束后采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并參照天根DNA純化回收試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接至經(jīng)相同酶切處理過的pPIC9K質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α感受態(tài)細胞中，菌液PCR篩選陽性克隆子后進行測序。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-AB。

利用UniProt的BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行氨基酸序列的同源性搜索。利用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用SignalP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）預測信號肽。利用ExPASy的ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。利用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測蛋白二級結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維模建。利用SAVES服務(wù)器（http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/）對同源建模的結(jié)果進行殘基角度檢驗。

1.3.2 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的誘導表達、純化及質(zhì)譜鑒定

參照質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒pPIC9K-AB。取30 μL經(jīng)PmeI酶（1 μg）線性化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至P. pastorisSMD1168感受態(tài)細胞，經(jīng)基礎(chǔ)葡萄糖（minimal dextrose，MD）平板初步篩選后，在遺傳霉素G418終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。挑取多個轉(zhuǎn)化子于YPD試管中培養(yǎng)，再進行破壁PCR選擇正確的轉(zhuǎn)化子。

以1%接種量將菌液接種至100 mL緩沖甘油復合（buffered glycerol-complex，BMGY）液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)至OD600nm為3。棄靜置3 h后的菌液上清液，再用緩沖甲醇復合（buffered methanolcomplex，BMMY）液體培養(yǎng)基重懸菌體，于30 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)。每隔24 h添加0.5%（V/V）的甲醇作為碳源誘導菌體表達，誘導7 d后于4 ℃、4 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為粗酶液。

phenyl疏水性層析：使用抽濾后的5 柱體積（column volume，CV）超純水清洗經(jīng)phenyl（GE）填充柱，再用含2 mol/L硫酸銨的0.01 mol/L pH 6.5乙酸鈉緩沖液平衡柱子備用；將平衡好的填料與經(jīng)2 mol/L硫酸銨溶液濃縮的粗酶液攪拌混勻約3 h，使目的蛋白與填料充分結(jié)合。通過5 CV 0.01 mol/L pH 6.5乙酸鈉緩沖液沖洗與phenyl填料結(jié)合的目的蛋白，合并有酶活力的組分。Q Sepharose HP陰離子交換層析：使用AKTAprime plus蛋白純化儀，參照配套的陰離子交換層析原則及方法說明書進行操作。將phenyl疏水性層析得到的酶液經(jīng)透析、濃縮后上樣。用pH 6.5 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液進行柱洗滌，1 mol/L氯化鈉溶液以1 mL/min流速進行線性洗脫（0%～60%），合并有酶活力的組分。Superdex 200 Increase 10/300 GL層析：將經(jīng)Q Sepharose HP陰離子交換層析得到的酶液上樣至預先經(jīng)pH 6.5 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液平衡的Superdex 200 Increase 10/300 GL層析柱，用相同緩沖液以0.4 mL/min流速洗脫目的蛋白，合并有酶活力的組分。

蛋白濃度的測定：根據(jù)全式金生物的EasyII Protein Quantitative Kit說明書配制工作液，以牛血清白蛋白溶液為標準溶液，測定樣品蛋白濃度。重組蛋白分子質(zhì)量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）測定。

質(zhì)譜鑒定：重組蛋白的鑒定是使用蛋白質(zhì)內(nèi)切酶胰蛋白酶對蛋白質(zhì)多肽樣品進行酶解，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）（nanoLC-QE）法對酶解后的樣品進行鑒定。再通過MASCOT等質(zhì)譜匹配軟件對LC-MS/MS數(shù)據(jù)進行分析，獲得目標蛋白質(zhì)分子的定性分析。

1.3.3 溫度對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響

在pH 5.0的條件下，分別測定溫度40～80 ℃時的酶活力，以測得的最高酶活力為100%，并計算其他溫度下的相對酶活力。為探究該酶的溫度穩(wěn)定性，將適量酶液在65 ℃恒溫水浴4 h，每隔30 min取樣，以及在70 ℃恒溫水浴30 min，每隔5 min取樣，均于最適條件下測定其殘余酶活力，以未處理酶活力為100%，分別計算處理不同時間后相對酶活力。

1.3.4 pH值對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響

用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 3.0～6.0）、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）配制不同pH值的2 mmol/LpNPA溶液。在最適反應溫度下測定酶活力，以最高酶活力為100%。通過測定酶液在不同pH值條件下4 ℃放置24 h后的殘余酶活力研究pH值穩(wěn)定性，以未處理酶活力為100%。

1.3.5 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的底物特異性及動力學常數(shù)

通過測定重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在最適條件下對2 mmol/L不同底物（pNPA、pNPX、pNPG、pNPM）或0.2%不同底物（山毛櫸木木聚糖、玉米芯木聚糖、甘蔗渣木聚糖）的活力，研究該酶的底物特異性。

測定重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在65 ℃于50 mmol/L pH 5.0乙酸鈉緩沖液中對不同濃度（1～6 mmol/L）pNPA溶液的活力。同時測定蛋白濃度，利用Lineweaver-Burk法計算獲得Km值和Vmax值。

1.3.6 金屬離子、抑制劑和表面活性劑對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響

通過測定酶在4 ℃被1 mmol/L或10 mmol/L的不同金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+、Al3+、Fe3+和Zn2+）處理24 h后的殘余酶活力，研究金屬離子對酶活力的影響，以未被金屬離子處理的酶活力為100%。

在酶液中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L抑制劑（EDTA、CTAB、Urea）和1%或10%（m/m）表面活性劑（SDS、Tween-20、Tween-80、Triton X-100），于4 ℃處理24 h后，測定酶的殘余活力，以未添加抑制劑或去垢劑的酶活力為100%，研究抑制劑和去垢劑對酶活力的影響。

1.3.7 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶對單糖耐受性及對柑橘汁的影響

通過先將單糖（L-阿拉伯糖、D-木糖）添加到最終濃度為0～2 mol/L的測定混合物中，于最適條件下測定酶活力，研究該酶對單糖的耐受性。

將去皮、去籽處理后的白柚經(jīng)榨汁機處理獲得果汁。經(jīng)3 500 r/min離心30 min后的上清液用于酶實驗[22]。然后，將10 mL樣品用0～30 U/mL酶液于50 ℃孵育1 h后，于沸水中加熱5 min使酶失活。將處理過的汁液以35 000 r/min離心10 min后，再通過分光光度計測定其在660 nm波長處透光率，以相對于蒸餾水的透光率百分比表示，所有實驗均一式3 份[23]。

1.3.8 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的測定

配制0.1 mol/L對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）母液和0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.0），稀釋成一系列濃度的pNP溶液。標準曲線反應體系：0.1 mol/LpNP（0～3.5 μL）與pH 5.0 0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液（100～96.5 μL）的混合液于50 ℃溫育15 min后，立即加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液，于410 nm波長處吸光度，繪制吸光度與pNP濃度曲線。酶活力測定：以pNPA為底物，取25 μL酶液、50 μL 0.05 mol/L pH 5.0乙酸鈉緩沖液與25 μL 2 mmol/LpNPA溶液混勻，于50 ℃溫育15 min后，立即加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，于410 nm波長處讀取吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

所有實驗均重復3 次。使用Excel 2010、Origin 9.1進行數(shù)據(jù)處理與分析，制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建及克隆表達

經(jīng)PCR擴增目的基因的0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A所示。PCR產(chǎn)物在2 000 bp附近出現(xiàn)特異性條帶。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后所挑取的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR鑒定，其1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1B所示，菌落1和5的PCR產(chǎn)物條帶單一，且分子質(zhì)量在2 000～3 000 bp之間，符合預期結(jié)果。提取菌落1和5的重組質(zhì)粒委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序，測序結(jié)果顯示，菌落1的目的片段正確插入載體中，表明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-AB。

圖1 AB基因擴增結(jié)果（A）及pPIC9K-AB菌液PCR鑒定結(jié)果（B）Fig. 1 Amplification of α-L-arabinofuranoside gene (A) and PCR identification of pPIC9K-AB (B)

用UniProt數(shù)據(jù)庫BLAST對相似性較高的前25 條氨基酸序列建立進化樹，結(jié)果如圖2所示。該酶（A0A100ITZ9）屬于GH51，其氨基酸序列與來自Aspergillus kawachii（Q8NK90）、A. awamori（Q96X54）、A. niger（P42254.1）、A. sclerotioniger（A0A317XE43）、A. terreus（Q0CTV2）、A. ruber（A0A017S9M9）的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分別具有99.5%、99.3%、97.3%、88.7%、78.1%、76.3%的相似性。

圖2 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Neighbor-joining tree of recombinant α-L-arabinofuranoside

利用SMART數(shù)據(jù)庫的信號肽預測工具SignalP 4.0預測信號肽，剪切位點位于第25位和第26位之間，在其N端有25個氨基酸為信號肽序列。利用ExPASy的ProtParam工具分析該蛋白序列的理化性質(zhì)，結(jié)果如下：該蛋白序列共包含628個氨基酸，分子式為C3043H4542N762O980S13，理論分子質(zhì)量約為67.896 kDa，理論等電點為4.09。預測在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，不穩(wěn)定系數(shù)為25.59，為穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)為77.98。總平均親水指數(shù)為-0.183，說明該蛋白是親水性蛋白。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的跨膜區(qū)預測結(jié)果（圖3A）顯示該蛋白不含跨膜區(qū)，是一種可溶性蛋白，適于分泌型表達。如圖3B所示，該酶的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲和β-折疊居多，其中氨基酸序列中α-螺旋占總二級結(jié)構(gòu)的21.18%；β-折疊占24.52%，β-轉(zhuǎn)角占5.73%，無規(guī)卷曲占48.75%。利用SWISS-MODEL對α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶進行同源建模，結(jié)果如圖3C所示。本研究的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶序列與來源于Meripilus giganteus的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（PDB登錄號6ZQ0）同源性為39.93%，故以它為模板進行同源建模。對所得蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模結(jié)果進行Verify3D評價，80%以上的氨基酸序列滿足特定的評分標準得到分數(shù)，說明建模結(jié)果可靠。從結(jié)果可以看到蛋白質(zhì)序列的得分比最小值為90.0%，說明該α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的蛋白質(zhì)序列的建模結(jié)果良好。建模結(jié)果（圖3C）表明該酶具有51家族水解酶家族特有的(α/β)8折疊桶（TIM桶）結(jié)構(gòu)，并且在桶的中心含有活性位點與活性空腔，以便于阿拉伯糖苷酶識別并結(jié)合底物。同時建模結(jié)果還表明該酶的桶狀結(jié)構(gòu)與β-三明治結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，桶的C端與N端處于同一β-折疊結(jié)構(gòu)域中，因此判斷其具有良好的耐熱性。

圖3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶跨膜區(qū)分析（A）、二級結(jié)構(gòu)預測（B）、三級結(jié)構(gòu)預測（C）Fig. 3 Prediction of transmembrane helices (A), secondary structure (B),and tertiary structure (C) of α-L-arabinofuranoside

2.2 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的誘導表達、純化及質(zhì)譜鑒定

重組質(zhì)粒pPIC9K-AB電轉(zhuǎn)化至P. pastorisSMD1168感受態(tài)細胞后，破壁PCR鑒定結(jié)果如圖4A所示，條帶數(shù)量、大小均符合預期。PCR產(chǎn)物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序，測序結(jié)果表明已成功構(gòu)建重組菌株。

利用BMGY和BMMY培養(yǎng)基對重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵7 d后的培養(yǎng)液，即為粗酶液。通過phenyl疏水柱、Q Sepharose HP陰離子交換柱、Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠過濾柱對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶進行純化，Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠過濾柱純化層析如圖4B所示，呈現(xiàn)單一峰形。如圖4C所示，SDSPAGE凝膠上呈現(xiàn)單一條帶。由純化過程參數(shù)（表1）可看出，最后得到該重組蛋白的純化倍數(shù)為5.13倍，比活力達到55.73 U/mg。從SDS-PAGE（圖4C）切出相應的條帶，并將進行胰蛋白酶水解的產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析。通過LC-MS/MS鑒定分離的重組的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（圖4D）。再通過MASCOT等質(zhì)譜匹配軟件對LC-MS/MS數(shù)據(jù)進行分析（FPGGNNLEGNSAENR、LANYGSETQDLSVSIPGTSTGK、GSVSEAVFmIGFER、SVPYFIGEYSR、ENGLKPQLANVLADMK、GDYSGDITVR），獲得目標蛋白質(zhì)多肽分子的定性鑒定信息。該重組蛋白鑒定為α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A（A. niger），UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號為A0A100ITZ9。

表1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的純化過程參數(shù)Table 1 Summary of the purification steps of α-L-arabinofuranoside

圖4 pPIC9K-AB的破壁PCR鑒定結(jié)果（A）、凝膠過濾純化（B）、SDS-PAGE分析（C）和LC-MS/MS鑒定結(jié)果（D）Fig. 4 PCR pattern of pPIC9K-AB with broken cell walls (A),gel filtration chromatogram (B), SDS-PAGE pattern (C) and LC-MS/MS chromatogram (D)

2.3 溫度對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響

如圖5A所示，重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在40～80 ℃范圍內(nèi)均有活性，最適反應溫度為65 ℃。如圖5B所示，重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在65 ℃處理90 min后，仍能保持60%以上的酶活力，在70 ℃處理10 min，酶活力僅有65%左右。相關(guān)研究報道，來源于Pseudopedobacter saltans、Bifidobacterium longumB667、B. breveK-110、Ruminiclostridium josui、Clostridium thermocellum的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最適溫度分別為50、45、45、45、50 ℃[9,24-27]。解西柱等[28]研究的來源于A. niger的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Anabf A最適溫度為50 ℃，其在60 ℃孵育30 min后，酶活力完全喪失。與相關(guān)文獻報道的同類酶相比，本研究發(fā)現(xiàn)的耐熱酶最適溫度更高，熱穩(wěn)定性也更好，更有利于工業(yè)應用。該酶耐熱性的原因可能與其緊密的結(jié)構(gòu)相關(guān)，該酶桶狀結(jié)構(gòu)與β-三明治結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合（圖3C），桶的C端與N端處于同一β-折疊結(jié)構(gòu)域中，因此其具有良好的耐熱性。

圖5 溫度和pH值對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的影響Fig. 5 Effects of temperature and pH on recombinant α-L-arabinofuranoside activity

2.4 pH值對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響

如圖5C所示，隨著pH值的升高，酶活力呈先上升后下降的趨勢，在乙酸鈉緩沖體系中活力較高，在pH 5.0時α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力最高。如圖5D可知，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在pH 3.0～8.0范圍內(nèi)處理24 h后均保持一定的活力，且較窄的pH值范圍（pH 4.0～8.0）條件下放置24 h后仍保持約70%的酶活力。該結(jié)果表明該重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在弱酸性和中性范圍內(nèi)具有良好的pH值穩(wěn)定性；這與真菌來源的酶通常最佳pH值在酸性范圍內(nèi)[29]的規(guī)律相符合。由于大多數(shù)果汁天然pH值為酸性，所以該重組酶在果蔬汁加工行業(yè)中存在一定的應用潛力[30]。

2.5 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的底物特異性及動力學常數(shù)

重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶對pNPA有一定的水解活性，對pNPG、pNPX、pNPM等人工底物以及山毛櫸木木聚糖、玉米芯木聚糖和甘蔗渣木聚糖等天然聚糖類底物沒有活性（數(shù)據(jù)未顯示）。通過測定重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在不同濃度pNPA（1～6 mmol/L）活力，計算得到的初始反應速率，利用Lineweavere-Burk法計算獲得酶促反應參數(shù)Km值和Vmax值分別為2.31 mmol/L和625 μmol/（mL·min）。來源于A. nigerND-1的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的Km為5.36 mmol/L[19]，與之相比，本研究中的重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的Km值更低，表明該酶與底物的親和力更大，可以作為工業(yè)應用的理想選擇。

2.6 金屬離子、抑制劑和表面活性劑對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響

金屬離子的存在可能多方面的影響酶活力，通過測定重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶被不同金屬離子處理后殘留的酶活力探究金屬離子對其影響，結(jié)果如圖6A所示。1 mmol/L的金屬離子K+對α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶有輕微促進作用，其酶活力提高了11%。該結(jié)果表明，K+離子可用作該酶的活化劑，可用于進一步的研究和開發(fā)。而1 mmol/L的Cu2+、Al3+卻能明顯抑制該酶活力性，其酶活力均低于50%。與Hu Yanbo等[31]研究的Al3+能抑制來源于Paenibacillus polymyxaKF-1的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的結(jié)論一致。1 mmol/L的Mn2+、Ca2+、Cd2+、Fe3+、Na+、Mg2+和Ba2+對重組酶活力也有不同程度的抑制作用，來源于Bacillus stearothermophilusT-6的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶被1 mmol/L的Mn2+處理后，其酶活力顯著提高[15]，與Yuan Ye等[32]的研究Mn2+是某些糖苷酶的酶增強劑結(jié)果相反，這也表明不同來源蛋白酶性質(zhì)有所差異。10 mmol/L的Cu2+、Cd2+、Al3+、Fe3+和Zn2+對該酶有抑制作用，酶活力均小于50%，其中Cu2+幾乎能完全抑制酶活力。與Patel等[33]研究Cu2+可催化自身半胱氨酸分子的氧化而導致分子內(nèi)或分子間二硫鍵或亞磺酸的形成，進而導致酶活力減弱結(jié)果一致。

圖6 金屬離子（A）、抑制劑和表面活性劑（B）對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響Fig. 6 Effects of metal ions (A), inhibitors and surfactants (B) on the activity of recombinant α-L-arabinofuranoside

探究抑制劑和表面活性劑對酶活力的影響，結(jié)果如圖6B所示。由于EDTA的添加對酶活力沒有顯著影響，這一結(jié)果表明酶的活性不需要金屬離子輔助[34]。重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的CTAB耐受能力較差，1 mmol/L的CTAB能使α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基本失活，尿素對α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有輕微抑制作用，而SDS對α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有輕微促進作用。低用量Tween-20能輕微促進酶活力，而1%的Tween-80、Triton X-100存在時，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力僅有80%以上，但高濃度條件下均抑制α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力。

2.7 重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶對單糖耐受性及對柑橘汁的影響

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用底物時，產(chǎn)物之一為L-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖可能是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的抑制劑；酶反應環(huán)境里也通常伴隨大量的D-木糖存在，也會抑制其活性，因此探究重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在不同濃度（0～2 000 mmol/L）L-阿拉伯糖、D-木糖存在下的酶活力情況，結(jié)果如圖7A所示。低濃度（＜400 mmol/L）時，L-阿拉伯糖的存在對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有輕微促進作用。隨著濃度進一步升高，L-阿拉伯糖存在對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力產(chǎn)生抑制作用，在1 000 mmol/L的濃度下，L-阿拉伯糖的抑制百分比為24.2%，比Hu Yanbo等[31]研究來源于Paenibacillus polymyxaKF-1的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（500 mmol/L，26.1%）的抑制效果更小。0～2 000 mmol/L的D-木糖存在時，重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力不但沒有受到抑制，反而有所提高，最高提高了32.76%（900 mmol/L），這可能如Florindo等[35]所述，糖和多元醇都在蛋白質(zhì)核心中的疏水殘基之間產(chǎn)生強相互作用使其剛性和穩(wěn)定性整體有所提高，從而導致其水解活性的顯著提高。與來源于Cellulosimicrobium aquatileLyp51的CaAraf51相比[10]，該酶對較高濃度的阿拉伯糖和木糖具有更好的耐受性。表明該酶不易受到酶促反應產(chǎn)物的反饋抑制，在半纖維素水解應用中具有強大的潛力。

圖7 單糖對重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影響（A）及重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶對柚子汁的影響（B）Fig. 7 Effect of monosaccharides on the activity of recombinant α-L-arabinofuranoside (A) and effect of recombinant α-L-arabinofuranoside on clarifying grapefruit juice (B)

果汁的濁度和黏度歸因于多糖的存在，例如纖維素、半纖維素、淀粉、果膠和結(jié)合的木質(zhì)素等[5]。酶促工藝廣泛用于果汁的提取和澄清中，它不僅降低了果汁的黏度，還為果汁提供了更高的澄清度、更濃郁的香氣和色彩[36]。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是外切酶，可從主鏈木聚糖上除去側(cè)鏈部分的L-阿拉伯呋喃糖基，并增強其他酶（如木聚糖酶和β-木糖苷酶）的作用[37]。為了探究重組α-L-阿拉伯呋喃糖是否可以用于酶促果汁澄清時的聚糖酶的復合酶，通過添加0～30 U/mL的重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶處理柚子汁，結(jié)果如圖7B所示，重組α-L-阿拉伯呋喃糖對柚子汁有澄清作用，加酶量為15 U/mL時，效果最好，其澄清度提高了15.18%，但隨著加酶量的增加，透光率卻下降。與高佳等[38]研究的果膠酶處理酸櫻桃果漿的結(jié)果一致。相關(guān)學者對此的解釋是使用的酶本質(zhì)為蛋白質(zhì)，蛋白過量會使果汁產(chǎn)生一定程度的渾濁，從而使果汁的透光率下降[39]。陳偉等[40]研究了重組嗜熱甘露聚糖酶對柿子汁、蘋果汁、桃汁和葡萄汁的澄清度分別提高了31.8%、7%、4%和4%。高佳等[38]研究了商業(yè)果膠酶在最優(yōu)條件下對酸櫻桃果漿的澄清度提高了13.13%。與此相比該酶對柚子汁的澄清效果顯著，可作為酶促果汁澄清時聚糖酶的復合酶使用。說明本研究中表達的重組α-L-阿拉伯呋喃糖具有顯著的果汁澄清效果，可作為果汁澄清新型酶進一步加以研究，后期可探究該酶協(xié)同聚糖酶（如果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶等）對果汁的澄清。

3 結(jié) 論

對A. niger的AB基因（UniProt：A0A100ITZ9）進行克隆并在畢赤酵母中進行異源表達后得到大小為85 kDa的重組蛋白。通過疏水柱、陰離子交換柱、分子篩等對重組蛋白進行純化后，其比活力為55.73 U/mg。最適反應溫度和pH值分別為65 ℃和5.0，在pH 4.0～8.0穩(wěn)定性較好。金屬離子K+對酶活力有促進作用，而Cu2+對酶活有明顯的抑制作用；以4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷為底物時測得該酶的Km值和Vmax值分別為2.31 mmol/L和625 μmol/（mL·min）；加酶量為15 U/mL時，對柚子汁的澄清效果最好，其澄清度提高了15.18%。本研究不僅豐富了現(xiàn)有的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶資源庫，同時為后續(xù)探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的應用提供了重要的理論參考。