姬雨雪，鄭麗麗，楊 旸，鐘 爽，艾斌凌，鄭曉燕，校 導(dǎo)，盛占武,*

（1.海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，海南 ?？?570102；3.海口市香蕉生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570102）

植物源多酚阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）（親水性）、槲皮素（quercetin，QT）（疏水性）和香草酸（vanillic acid，VA）（兩親性）等具有抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集和血栓形成的作用[1-3]。多酚對(duì)外界環(huán)境（如光和熱等）的變化非常敏感，穩(wěn)定性差，易被氧化形成醌類物質(zhì)失去活性，限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用[4]。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）的結(jié)構(gòu)中含多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，作為蛋白質(zhì)載體與多酚結(jié)合后可提高多酚的穩(wěn)定性和溶解度，也可改善蛋白質(zhì)的環(huán)境敏感性。如今，β-LG被廣泛用作包封劑，如納米顆粒[5-7]、乳化劑[8-9]和納米復(fù)合物[10]。李曉雷等[11]采用β-LG作為載體，使用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在與β-LG結(jié)合后，QT的溶解度提高了1 844 倍。

納米材料是指50%及以上的顆粒尺寸分布在1～100 nm[12]。由于納米顆粒粒徑較小，被包埋的生物活性物質(zhì)可以更容易地穿過小腸細(xì)胞壁，增加生物活性物質(zhì)在血液中的濃度，提高其生物利用率[13]。乳化-蒸發(fā)法是制備納米顆粒的方法之一。先將有機(jī)相（活性物質(zhì)）加入水相（乳化劑）中，經(jīng)過高速剪切、高壓均質(zhì)和微射流等均質(zhì)手段形成液滴。然后，在真空條件下蒸發(fā)掉液滴中的有機(jī)溶劑，即可形成納米包埋顆粒。納米顆粒的大小可以通過改變均質(zhì)次數(shù)與壓力、乳化劑的類型和用量、有機(jī)相和水相的體積比例等進(jìn)行控制。為了獲得較小的粒徑，通常采用微射流等高能量的均質(zhì)手段[14]。Bengoechea等[15]利用乳化-蒸發(fā)法制備了食物蛋白包埋植物甾醇的納米顆粒輸送體系，具有較好的穩(wěn)定性和分散性。杜文凱[16]制備了β-LG-表沒食子兒茶素沒食子酸酯納米顆粒，有效提高了表沒食子兒茶素沒食子酸酯的抗氧化活性及抗腫瘤活性。金建昌[17]將4 種兒茶素分別與熱誘導(dǎo)β-LG結(jié)合制成納米顆粒，結(jié)果證明復(fù)合物納米顆粒延長(zhǎng)了兒茶素的抗氧化時(shí)效，并對(duì)兒茶素有保護(hù)和緩釋效應(yīng)。

目前關(guān)于β-LG作為綠色生物載體的研究多集中在與單一小分子結(jié)合形成單配體復(fù)合物納米顆粒方面[18-19]。課題組前期進(jìn)行了3種多酚與蛋白結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，探究多酚添加順序?qū)?fù)合物負(fù)載能力的影響，并且在復(fù)合物抑制食品中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的研究結(jié)果表明，β-LG與3種多酚形成的三配體復(fù)合物對(duì)AGEs的抑制效果比多酚單體的效果更好，因其單體之間具有疊加增效作用且多酚與蛋白結(jié)合增強(qiáng)了多酚穩(wěn)定性[20]。因此，本研究以具有多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)的β-LG為載體，以植物來源的FA、QT與VA為配體，制備同時(shí)負(fù)載3種活性物質(zhì)的蛋白多酚復(fù)合物，并在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化乳化-蒸發(fā)法制備納米顆粒的工藝，進(jìn)一步降低復(fù)合物粒徑，增強(qiáng)多酚穩(wěn)定性，提高β-LG作為生物載體的利用率，為開發(fā)新型的復(fù)合納米顆粒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-LG（18.4 kDa，純度≥90%） 上海源葉生物科技有限公司；VA（純度≥97%）、FA（純度≥99%）、QT（純度≥96.5%） 中國(guó)食品藥品檢定研究所；乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純）西隴化工股份有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純），8-苯胺萘-1-磺酸銨鹽（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Chirascan型圓二色性光譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；UPLC I-Class型超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；Ultra-TurraxT25高速分散器（配制S25N18G探頭）德國(guó)IKA公司；APV-1000微射流高壓均質(zhì)機(jī) 加拿大ATS公司；RTOP-500Y智能光控制箱 浙江拓普云農(nóng)科技公司；Zetasizer Nano-ZS90動(dòng)態(tài)多分散粒徑儀 英國(guó)Malvern公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1β-LG三配體復(fù)合物的制備

根據(jù)Sim?es等[21]的方法，稍作修改。取β-LG（15 mg/mL）在磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 6）中溶解，加入0.02%疊氮化鈉用作防腐劑以避免微生物生長(zhǎng)。在室溫（25 ℃）條件下，400 r/min連續(xù)攪拌120 min。將β-LG溶液在4 ℃保存過夜，以確保蛋白質(zhì)完全水化。通過0.2 μm濾膜過濾樣品，去除蛋白質(zhì)聚集物和雜質(zhì)。將β-LG溶液放入具塞玻璃管中，在80 ℃水浴加熱15 min，取出后在冰中冷卻10 min。

將FA、QT和VA分別溶解在磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 6）、無水乙醇和70%乙醇溶液中，避光保存。向β-LG溶液加入0.02～0.12 mg/mL不同質(zhì)量濃度的FA、QT和VA（乙醇含量最多為18%），按照FA＞QT＞VA的順序[20]以1 h的間隔依次加入。

1.3.2β-LG三配體復(fù)合物納米顆粒的制備

將1.3.1節(jié)獲得復(fù)合物溶液用高速分散器在5 000 r/min分散2 min，分別在微射流壓力40、60 MPa和80MPa下均質(zhì)1～3 次。通過 40 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑，使得到的樣品中乙醇含量為0。

1.3.3 粒徑、多分散指數(shù)和Zeta電位

在波長(zhǎng)633 nm的He-Ne激光驅(qū)動(dòng)下，通過動(dòng)態(tài)多分散粒徑儀測(cè)量顆粒尺寸、多分散指數(shù)和Zeta電位。取稀釋100 倍后的樣品[21]1.5 mL分別倒入徑長(zhǎng)10 mm的一次性石英比色皿和電極比色皿，檢測(cè)角度為13°。測(cè)試3 次取平均值。

1.3.4 多酚的加載率與加載量

參照鄧楚君[22]、Cheng Hao等[23]的方法，稍作修改。將復(fù)合物納米顆粒置于超濾離心管中，在14 000 r/min、4 ℃離心15 min。利用超高效液相色譜測(cè)定濾液中3種游離多酚單體的含量。將保留在過濾裝置中的復(fù)合物在55 ℃通風(fēng)的烘箱中干燥24 h并稱質(zhì)量。按下式計(jì)算其加載率和加載量：

FA檢測(cè)色譜條件：參照傅超等[24]的方法，略有修改。BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.2%甲醇-乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～9 min，10% A，90% B；9～15 min，10%～30% A，90%～70% B；15～25 min，30% A，70% B；檢測(cè)波長(zhǎng)324 nm；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

QT檢測(cè)色譜條件：參照石曉峰等[25]的方法，略有修改。 BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～9 min，5% A，95% B；9～10 min，5%～45% A，95%～55% B；10～20 min，45% A，55% B；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

VA檢測(cè)色譜條件：參照鄒曉紅等[26]的方法，略有修改。BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～15 min，5% A，95% B；15～25 min，5%～20% A，95%～80% B；25～30 min，20% A，80% B；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.5 穩(wěn)定性

1.3.5.1 貯藏穩(wěn)定性

樣品充N2后室溫環(huán)境下避光保存35 d，每7 d取樣測(cè)定粒徑及其多分散指數(shù)，考察樣品貯藏過程中粒徑的變化[20]。

1.3.5.2 光穩(wěn)定性

將樣品放置在離LED光源約9～10 cm處，光照強(qiáng)度為4 000 lx，溫度保持在25 ℃左右，每6 h用超高效液相色譜測(cè)定一次樣品中FA、QT與VA含量變化[27]。

1.3.5.3 熱穩(wěn)定性

將樣品分別置于25、35、45 ℃和55 ℃的避光水浴鍋中。8 h后取樣，使用超高效液相色譜測(cè)定樣品中FA、QT與VA含量的變化[28]。

1.3.6 熒光光譜

在25 ℃條件下，取樣品稀釋至恒定蛋白質(zhì)量濃度（0.20 mg/mL），分別收集激發(fā)波長(zhǎng)在260～340 nm（Δλ=15 nm）和220～360 nm（Δλ=60 nm）的同步熒光光譜[29]。

在25 ℃條件下，取樣品稀釋至恒定蛋白質(zhì)量濃度（0.20 mg/mL）分別測(cè)定三維熒光圖譜。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)200～350 nm（采樣間隔2 nm），發(fā)射波長(zhǎng)200～500 nm（采樣間隔2 nm）[29]。

在25 ℃條件下，取樣品稀釋至恒定蛋白質(zhì)量濃度（0.20 mg/mL）分別測(cè)定外源熒光光譜。避光條件下，用甲醇制備1.36 mmol/L的ANS儲(chǔ)備溶液。將20 μL ANS溶液加入樣品（4 mL）中，并在25 ℃孵育10 min。測(cè)量條件：激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)400～600 nm[30]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜

將干燥的納米顆粒與KBr以1∶100的比例混合于瑪瑙研缽中，研磨混勻，壓片后制成透明薄片，放置紅外光譜儀中以4 cm-1的分辨率從4 000～500 cm-1進(jìn)行頻率掃描。

1.3.8 圓二光譜

在185～260 nm的范圍內(nèi)，以1 nm/0.5 s的速率，0.2 nm分辨率測(cè)量。將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度設(shè)為0.20 mg/mL，遠(yuǎn)紫外區(qū)的路徑長(zhǎng)度設(shè)為0.5 mm，數(shù)據(jù)采集時(shí)采用恒定的氮?dú)鉀_洗。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用CD pro軟件分析各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[31]

1.3.9 透射電子顯微鏡觀察

在80 kV加速電壓下，采用負(fù)染色法，將樣品分散液滴在銅網(wǎng)格碳支撐膜上，并在2 min后用濾紙和干燥的網(wǎng)格去除多余的溶液。用負(fù)染液磷鎢酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%）在15 s內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染，網(wǎng)格在室溫下風(fēng)干后進(jìn)行觀察[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖處理，采用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米顆粒制備工藝優(yōu)化

為最大程度排除微射流均質(zhì)壓力的影響，針對(duì)不同均質(zhì)次數(shù)對(duì)復(fù)合物粒徑影響的研究中選取3個(gè)不同壓力，結(jié)果見表1。當(dāng)壓力分別為40、60 MPa和80 MPa時(shí)，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，復(fù)合物粒徑呈現(xiàn)上升現(xiàn)象，平均粒徑最小值均出現(xiàn)于第1次均質(zhì)的過程中，因此確定最佳均質(zhì)次數(shù)為1 次；隨著微射流均質(zhì)壓力的增加，復(fù)合物粒徑呈現(xiàn)先降低后增加的現(xiàn)象，平均粒徑最小值出現(xiàn)于60 MPa的均質(zhì)過程中，當(dāng)均質(zhì)壓力進(jìn)行至80 MPa，復(fù)合物的粒徑及相應(yīng)多分散指數(shù)有所增加。次數(shù)和壓力的增加會(huì)導(dǎo)致多分散指數(shù)和粒徑增加，推測(cè)是由于均質(zhì)過程中提供大量能量導(dǎo)致新液滴的快速重聚集，即“過處理現(xiàn)象”。高頻的聚集現(xiàn)象和極高的能量密度是產(chǎn)生“過處理現(xiàn)象”發(fā)生的主要原因之一[32]。而經(jīng)過60 MPa壓力下第1次均質(zhì)過程產(chǎn)生的復(fù)合物具有較低的多分散指數(shù)，表明經(jīng)此條件制備的復(fù)合物分散性最好。因此，在本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究中，通過對(duì)復(fù)合物進(jìn)行60 MPa、1 次微射流均質(zhì)處理獲得復(fù)合物納米顆粒。

表1 不同均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)下復(fù)合物的平均粒徑、多分散指數(shù)與Zeta電位Table 1 Mean size, polydispersity index and zeta potential of composite nanoparticles prepared with different homogenization pressures and different homogenization cycles

2.2 粒徑、多分散指數(shù)和Zeta電位

如表2所示，經(jīng)過80 ℃熱處理15 min的β-LG平均粒徑為185.6 nm，添加多酚后，復(fù)合物平均粒徑在130.8～156.2 nm之間，為亞微米級(jí)，可見，多酚的加入使復(fù)合物粒徑降低，這主要是因?yàn)?種多酚與蛋白發(fā)生結(jié)合，使蛋白分子間相互作用減少，表現(xiàn)為粒徑的降低[33]。經(jīng)過乳化-蒸發(fā)方法制備的復(fù)合物平均粒徑在74.5～80.7 nm之間，為納米顆粒?？梢姡榛?蒸發(fā)法進(jìn)一步減小了復(fù)合物粒徑，可能是由于在真空條件下，復(fù)合物中的有機(jī)溶劑蒸發(fā)后液滴收縮導(dǎo)致[34]。

不同多酚質(zhì)量濃度的復(fù)合物納米顆粒多分散指數(shù)都小于0.21，證明復(fù)合物納米顆粒粒徑呈單峰分布且穩(wěn)定均勻。從表2可以看出，隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物納米顆粒的粒徑呈下降趨勢(shì)，多酚質(zhì)量濃度在0.12 mg/mL時(shí)，粒徑趨于平穩(wěn)，證明多酚質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合物粒徑有一定影響，在質(zhì)量濃度0.08 mg/mL條件下的粒徑和多分散指數(shù)最優(yōu)，但隨著多酚質(zhì)量濃度的增加Zeta電位未發(fā)生規(guī)律性的變化。三配體復(fù)合物的粒徑隨多酚質(zhì)量濃度的增加而增加，在0.12 mg/mL時(shí)多分散指數(shù)明顯提高，說明此質(zhì)量濃度下的復(fù)合物粒徑不均勻，呈多峰分布，可能是蛋白結(jié)合位點(diǎn)飽和，未結(jié)合的多酚分布在復(fù)合物中，而復(fù)合物納米顆粒未出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)榧{米結(jié)構(gòu)具有更大的比表面積，可結(jié)合更多的化合物[33]。綜合分析，選擇最穩(wěn)定的質(zhì)量濃度0.08 mg/mL多酚的納米顆粒進(jìn)行后續(xù)表征。

表2 復(fù)合物的平均粒徑、多分散指數(shù)與Zeta電位Table 2 Mean size, polydispersity index and zeta potential of composite nanoparticles

2.3 加載率與加載量

表3 FA、QT和VA在復(fù)合物中加載率和加載量Table 3 Loading efficiency and loading capacity of FA, QT and VA in composite nanoparticles

表3顯示復(fù)合物納米顆粒中FA、QT和VA的加載率分別為86.78%、75.00%和86.4%。三配體復(fù)合物FA、QT和VA的加載率分別為60.11%、37.09%和68.93%。復(fù)合物納米顆粒的加載率均明顯高于三配體復(fù)合物，其中，復(fù)合物納米顆粒中FA、QT和VA比三配體復(fù)合物高26.67%、37.91%和17.47%，這可能是因?yàn)榧{米結(jié)構(gòu)具有更大的比表面積和體積比，能結(jié)合更多小分子，這與粒徑結(jié)果一致。在復(fù)合物中，F(xiàn)A與VA的加載量都高于QT，這可能是QT的疏水性所致，而經(jīng)乳化-蒸發(fā)處理后的納米顆粒中，QT的加載率升高約38%。

2.4 穩(wěn)定性

2.4.1 熱穩(wěn)定性

如圖1所示，隨著溫度的升高，復(fù)合物納米顆粒中FA加載率變化不明顯，而QT和VA呈下降趨勢(shì)；三配體復(fù)合物中多酚加載率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因可能是熱處理減弱了β-LG與多酚之間作用力，使部分多酚從β-LG上解離，失去β-LG的保護(hù)所致。Prigent等[35]研究了在5、25 ℃和60 ℃條件下牛血清白蛋白與綠原酸的非共價(jià)作用，結(jié)果顯示，兩者的結(jié)合能力隨著溫度的升高而降低，這與本研究結(jié)果一致。

圖1 不同溫度下復(fù)合物中FA（A）、QT（B）和VA（C）的加載率Fig. 1 Loading efficiency of FA (A), QT (B) and VA (C) in composite nanoparticles at different temperatures

2.4.2 光穩(wěn)定性

如圖2所示，在可見光照射24 h之內(nèi)，復(fù)合物中FA、QT和VA的加載率呈下降趨勢(shì)。納米顆粒中FA、QT和VA的多酚加載率分別下降12%、8%和4%，三配體復(fù)合物中FA、QT和VA的多酚加載率分別下降13%、21%和10%?？梢钥闯?，復(fù)合物納米顆粒加載率的下降速率低于三配體復(fù)合物。在照射24 h后，復(fù)合物中多酚的加載率下降速率顯著增大，而在對(duì)照組在避光條件下，多酚加載率的變化較小。

圖2 不同光照時(shí)間下多酚單體在復(fù)合物中的加載率Fig. 2 Loading efficiency of polyphenol monomers in composite nanoparticles with different light exposure durations

2.4.3 貯藏穩(wěn)定性

由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合物粒徑逐漸變大，這主要是由于多酚和蛋白的聚集體是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)顆粒之間發(fā)生相互聚集使界面自由能降低，從而導(dǎo)致復(fù)合物粒徑的增大[36]。貯藏35 d后，復(fù)合物納米顆粒的粒徑仍然小于100 nm，說明其穩(wěn)定性較高。

圖3 貯藏穩(wěn)定性Fig. 3 Storage stability of composite nanoparticles

2.5 熒光光譜

2.5.1 同步熒光光譜

采用同步熒光光譜法對(duì)熒光團(tuán)微環(huán)境的變化進(jìn)行表征[37]。如圖4所示，加入3種多酚后2 種樣品的熒光強(qiáng)度均明顯降低，說明多酚的加入對(duì)β-LG的微環(huán)境造成了影響，色氨酸的熒光強(qiáng)度下降較多，說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化主要發(fā)生在色氨酸基團(tuán)附近[38]。

圖4 復(fù)合物同步熒光光譜圖Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of composite nanoparticles

2.5.2 外源熒光光譜

通過熒光疏水探針ANS的結(jié)合，檢測(cè)蛋白質(zhì)疏水性的變化。β-LG具有不同的2個(gè)ANS結(jié)合位點(diǎn)，一部分位于內(nèi)部（即在疏水蛋白核內(nèi)），含有二硫鍵；以及另一部分位于外部（即靠近蛋白表面的疏水斑），負(fù)責(zé)非特異性的ANS相互作用[39-40]。如圖5所示，加入多酚后，蛋白疏水性顯著降低，可能是因?yàn)槎喾拥募尤胧沟鞍资杷畢^(qū)與ANS結(jié)合的位點(diǎn)減少，這與羅舒菡[41]研究結(jié)果一致。蛋白疏水性隨著復(fù)合物粒度的降低而降低，這可能是納米顆粒制備過程中經(jīng)過微射流均質(zhì)的處理。在高壓剪切作用下，蛋白顆粒表面暴露出了更多的可與多酚結(jié)合的內(nèi)部疏水基團(tuán)[42]，導(dǎo)致更少的疏水性氨基酸與ANS結(jié)合。這也可以解釋當(dāng)加入多酚質(zhì)量濃度相同時(shí)，復(fù)合物納米顆粒比三配體復(fù)合物具有更高的加載率。

圖5 復(fù)合物外源熒光光譜圖Fig. 5 Extrinsic fluorescence emission spectra of composite nanoparticles

2.5.3 三維熒光光譜

三維熒光光譜是當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)變化時(shí)，獲得的熒光強(qiáng)度變化，它可以提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的更多細(xì)節(jié)。圖6中存在4個(gè)峰：a、b、c和d。峰a代表Trp和Tyr殘基的光譜特征峰；峰b與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)；峰c代表瑞利散射峰；峰d代表二階散射瑞利散射峰[43]。從圖6A、B可知，由于FA、QT和VA的加入，峰a和峰b的熒光強(qiáng)度逐漸降低，這說明FA、QT和VA不僅可以影響Tyr和Trp殘基附近的微環(huán)境，還可能造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。且復(fù)合物納米顆粒（圖6C）的峰b明顯比三配體復(fù)合物（圖6B）的峰b低，說明前者的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化比后者大。

圖6 β-LG（A）、三配體復(fù)合物（B）和復(fù)合物納米顆粒（C）的三維熒光圖譜Fig. 6 Fluorescence excitation-emission matrix landscapes of β-LG (A),three-ligand composite (B) and nanoparticles (C)

2.6 紅外光譜

用紅外光譜分析多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的構(gòu)象變化，1 700～1 600 cm-1峰位的酰胺I帶與蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。如圖7所示，酰胺I帶（C＝O拉伸）從1 639.37 cm-1（線d）顯著移動(dòng)到1 643.35 cm-1（線f），這種位移變化是蛋白與多酚相互作用的結(jié)果，根據(jù)Tao Yang等[44]的研究，花青素與β-LG等蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)增多，這與本研究結(jié)果一致。與此同時(shí)，比較β-LG（線d）、三配體復(fù)合物（線e）和納米顆粒復(fù)合物（線f）的紅外光譜，發(fā)現(xiàn)位于3 363.45 cm-1的羥基振動(dòng)峰轉(zhuǎn)移到了3 354.24 cm-1，這是因?yàn)榈鞍字絮０返陌被cFA（線a）、QT（線b）和VA（線c）的羥基之間發(fā)生了相互作用而形成了氫鍵，氫鍵的形成會(huì)使伸縮振動(dòng)波數(shù)移向低波數(shù)，這說明多酚已被蛋白包埋[45]。

圖7 多酚單體與復(fù)合物的傅里葉紅外光譜Fig. 7 FTIR spectra of polyphenol monomers and composite nanoparticles

2.7 圓二色譜結(jié)果

β-LG與多酚等小分子相互作用可能導(dǎo)致β-LG二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)變化。由表4可知，與純?chǔ)?LG相比，復(fù)合物納米顆粒中的α-螺旋相對(duì)含量由11.0%增加到35.3%，三配體復(fù)合物中的α-螺旋相對(duì)含量由11.0%增加到15.1%，這可能是多酚與蛋白的相互作用引起了多肽鏈的收縮，形成新的氫鍵所致。兒茶素與β-LG相互作用研究表明，兒茶素使β-LG中的α-螺旋相對(duì)含量增加，β-LG結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與本研究結(jié)果一致[46]。

表4 復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 4 Changes of secondary structures in composite nanoparticles

2.8 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

如圖8所示，經(jīng)過80 ℃熱處理15 min的β-LG呈球形且有聚集（圖8A）；三配體復(fù)合物（圖8B）為圓形且分布均勻，并且在負(fù)染過程中形成了團(tuán)簇；圖8C、D分別為0.12 mg/mL和0.08 mg/mL多酚質(zhì)量濃度下的復(fù)合物納米顆粒，外形近似橢圓形，粒徑在50～60 nm之間，與動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果一致。

圖8 復(fù)合物透射電鏡圖Fig. 8 TEM images of composite nanoparticles

3 結(jié) 論

利用熱變性后的β-LG為載體同時(shí)負(fù)載FA、QT和VA三種多酚，制備三配體復(fù)合物。再利用乳化-蒸發(fā)法成功制備出低于100 nm的復(fù)合物納米顆粒，探究微射流壓力、均質(zhì)次數(shù)和多酚質(zhì)量濃度對(duì)納米顆粒的影響。結(jié)果表明，在微射流均質(zhì)壓力為60 MPa、均質(zhì)1 次，加入的多酚質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，可獲得粒徑分布穩(wěn)定的復(fù)合物納米顆粒。通過分析同步熒光、三維熒光、外源熒光光譜的變化發(fā)現(xiàn)多酚對(duì)復(fù)合物蛋白的微環(huán)境、二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性有明顯影響，乳化-蒸發(fā)法使蛋白表面疏水性升高，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化更明顯；通過紅外色譜分析，多酚與蛋白主要通過氫鍵結(jié)合。通過圓二色譜進(jìn)一步分析復(fù)合物中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，相較β-LG，復(fù)合物納米顆粒的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大；相較三配體復(fù)合物，納米顆粒的α-螺旋相對(duì)含量增加，β-折疊相對(duì)含量減少，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量基本不變，無規(guī)卷曲增加；透射電子顯微鏡圖像結(jié)果顯示，2 種復(fù)合物均呈橢圓形，與三配體復(fù)合物相比，納米顆粒分布更均勻、粒徑更小。通過動(dòng)態(tài)光散射和超高效液相色譜分析，復(fù)合物納米顆粒對(duì)3種多酚的加載率和穩(wěn)定性均高于三配體復(fù)合物。綜上，可以推測(cè)出在乳化-蒸發(fā)過程中，微射流均質(zhì)使蛋白暴露出更多多酚結(jié)合位點(diǎn)，提高蛋白的加載率；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑則顯著提高了復(fù)合物的粒徑，使其達(dá)到納米級(jí)，并將多酚包埋在蛋白內(nèi)，因納米顆粒具有尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)等特性，又可顯著提高多酚穩(wěn)定性，這為構(gòu)建多種活性物質(zhì)的包埋與輸送體系提供了理論基礎(chǔ)。