高 瑾，梁宏閃，趙靖昀，代亞磊，萬楚筠，周 彬,*

（1. 湖北工業(yè)大學 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點實驗室，湖北 武漢 430062）

食品體系是典型的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等復雜組分共存的軟物質(zhì)體系，這些分子之間可通過各種共價、非共價相互作用共同影響著食品的質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)及品質(zhì)等，亦或是賦予食品體系中某單一組分所不具備的功能特性[1]。例如，蛋白質(zhì)作為重要的食品組分，憑借其獨特的界面特性和健康屬性而倍受青睞，在食品體系（牛奶、蛋黃醬、冰淇淋、蛋白飲料等）中發(fā)揮乳化、發(fā)泡等功能[2-3]。然而并非所有的蛋白質(zhì)均具有優(yōu)異的界面特性。很多蛋白質(zhì)需在較高的濃度水平下才能對界面起到穩(wěn)定作用且其穩(wěn)定性也是長期面臨的技術難題[4-5]。更有甚者，某些蛋白質(zhì)特殊的結(jié)構(gòu)導致其親水性或疏水性過強，因而不易在界面形成穩(wěn)定牢固的界面膜[6]。

玉米醇溶蛋白作為典型的醇溶蛋白，主要存在于玉米胚乳中，是玉米制品加工過程中的主要副產(chǎn)物，具有特殊的氨基酸組成，分子中存在大量非極性氨基酸，僅能溶于60%～95%的醇類溶液、高濃度尿素溶液、強堿溶液等[7]。這種苛刻的溶解條件極大地限制了其應用范圍。由于它具有強疏水性，故可以利用簡易的反溶劑法制備膠體顆粒用于食品、醫(yī)藥等領域，從而引起學者的廣泛關注。但是單獨的玉米醇溶蛋白膠粒也正是因為其強疏水性導致其界面穩(wěn)定性較差[8]。然而已有研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白與單寧酸（tannic acid，TA）通過非共價相互作用之后制備得到的復合納米膠粒相比于單純的玉米醇溶蛋白膠粒的界面穩(wěn)定性顯著提高，可在油水界面形成連續(xù)的界面網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[9]。又如小麥醇溶蛋白與TA非共價結(jié)合不僅可提高小麥醇溶蛋白膠體顆粒的穩(wěn)定性，亦可增加其穩(wěn)定的Pickering乳液的貯藏穩(wěn)定性[10]。除此之外，多酚作為食品中常見的功能性化合物，廣泛存在于植物組織中，具有良好的抗氧化、抗菌、抗腫瘤等功能特性[11-12]。其豐富的酚羥基可通過靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用等非共價鍵與食品中蛋白質(zhì)形成復合物，進而改變蛋白質(zhì)的營養(yǎng)與功能特性[13]。但不同結(jié)構(gòu)的多酚對于同種蛋白的影響迥異。例如，TA、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子酸（gallic acid，GA）含有不同數(shù)量的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)單元，它們對于玉米醇溶蛋白膠粒界面特性的影響有巨大的差異。故而探究不同結(jié)構(gòu)多酚與玉米醇溶蛋白相互作用的差異，有助于解析多酚對玉米醇溶蛋白功能特性的影響機制，并對食品的結(jié)構(gòu)化設計及新型食品配料的開發(fā)與利用提供理論指導。

本實驗基于以往研究報道及團隊前期研究結(jié)果[14-15]，選取玉米醇溶蛋白與含有不同數(shù)量鄰三元酚結(jié)構(gòu)單元的多酚（TA、EGCG、GA）為研究對象，采用熒光光譜、紫外-可見光譜等技術手段解析3種多酚與玉米醇溶蛋白之間的相互作用，探討多酚結(jié)構(gòu)與二者比例對玉米醇溶蛋白-多酚膠體粒子微觀結(jié)構(gòu)及表面特性的影響，并研究玉米醇溶蛋白-多酚復合體系的抗氧化特性。該工作的開展有助于關聯(lián)其形成的復合物在食品體系的物理化學性質(zhì)，為復合物在食品配方中的優(yōu)化提供科學依據(jù)，擴展蛋白質(zhì)與多酚及其復合物在食品等工業(yè)領域的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白 日本東京化學工業(yè)有限公司；TA、EGCG、1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GA 上海源葉生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 蘇州島津儀器有限公司；Nicoletis-50傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FESEMs-4800掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；DSC1差示掃描量熱儀 瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白-多酚復合物的制備

玉米醇溶蛋白與TA、EGCG、GA的非共價復合物的制備過程參考相關研究方法[15]。將玉米醇溶蛋白及TA、EGCG、GA溶于70%乙醇溶液中，玉米醇溶蛋白母液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，TA、EGCG、GA母液質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。依次取不同體積的多酚溶液于10 mL玉米醇溶蛋白母液當中，不調(diào)節(jié)其溶液pH值，在室溫條件下攪拌1 min，所得溶液為非共價復合物溶液。添加TA、EGCG、GA體積分別為0、25、50、75、150、200、300、400 μL。

1.3.2 熒光光譜分析

1.3.2.1 熒光光譜的測定

利用熒光分光光度計獲得3種溫度（25、30 ℃和35 ℃）下的玉米醇溶蛋白及其復合物的內(nèi)源熒光圖譜[16]。玉米醇溶蛋白的質(zhì)量濃度固定為0.5 mg/mL，激發(fā)波長設置為280 nm，發(fā)射波長為300～500 nm，激發(fā)狹縫寬為10 nm，發(fā)射狹縫寬為5 nm。

1.3.2.2 熒光猝滅類型分析

利用Stern-Volmer方程對熒光數(shù)據(jù)進行分析，以驗證其猝滅類型[17]。如式（1）所示：

式中：F為有猝滅劑時玉米醇溶蛋白的熒光強度；F0為無猝滅劑時玉米醇溶蛋白的熒光強度；Kq為速率常數(shù)；τ0為無猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命，取其值為10-8s；[Q]為猝滅劑濃度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

1.3.2.3 結(jié)合位點及結(jié)合常數(shù)

玉米醇溶蛋白與TA、EGCG、GA的結(jié)合位點及結(jié)合常數(shù)[17]按式（2）計算：

式中：Kb為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)。

1.3.2.4 熱力學參數(shù)

按式（3）、（4）[17]計算熱力學參數(shù)：

式中：R為氣體常數(shù)，約為8.314 J/（mol·K）；T為實驗溫度/K；Kb為與溫度T對應的結(jié)合常數(shù)；ΔG為吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

1.3.3 紫外-可見光吸收光譜

采用紫外-可見分光光度法測定玉米醇溶蛋白及其復合物的紫外-可見吸收光譜。固定玉米醇溶蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將樣品置于光程為1 cm的比色皿中進行掃描。掃描范圍為190 ～500 nm[10]。

1.3.4 玉米醇溶蛋白與多酚復合納米顆粒的制備

將玉米醇溶蛋白與多酚同時溶于70%乙醇溶液中，利用反溶劑法制備復合納米顆粒[9]。即將1 mL復合溶液快速加入到9 mL水溶液中，所制備的復合溶液中玉米醇溶蛋白終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，多酚終濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mmol/L。

1.3.5 玉米醇溶蛋白與多酚復合納米顆粒的外觀形貌及濁度

利用紫外-可見光分光光度計測量復合納米顆粒溶液在波長600 nm處的吸光度，按式（5）換算得到溶液的透光率，以溶液透光率表示樣品濁度[18]。

式中：T為透光率/%；A為吸光度。

1.3.6 玉米醇溶蛋白與多酚復合納米顆粒表征

利用納米粒度及電位分析儀檢測玉米醇溶蛋白與多酚復合納米顆粒的粒徑及電位[9]。

1.3.7 玉米醇溶蛋白與多酚復合納米顆粒的微觀結(jié)構(gòu)

使用掃描電子顯微鏡觀察復合顆粒的微觀結(jié)構(gòu)[9]。取少量樣品均勻鋪展在錫箔紙表面，粘貼于雙面導電膠上，噴金。在放大倍數(shù)為10 000條件下觀察。

1.3.8 玉米醇溶蛋白與多酚復合物熱穩(wěn)定性分析

取4 mg玉米醇溶蛋白-多酚復合物樣品于坩堝中密封，以密封的空坩堝作為空白對照，測試溫度范圍為25～150 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮氣流速為30 mL/min。

1.3.9 玉米醇溶蛋白與多酚復合物抗氧化性分析

1.3.9.1 DPPH自由基清除活性

配制1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，避光攪拌1 h使其充分溶解，4 ℃貯藏備用。實驗中固定玉米醇溶蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，在10 mL玉米醇溶蛋白溶液中添加400 μL多酚溶液（1 mg/mL）得到復合物備用。取200 μL復合物樣品與3.8 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）混合30 s后，避光反應1 h，利用紫外-可見分光光度計，測定其在波長517 nm處的吸光度，DPPH自由基清除率按式（6）[10]計算：

式中：A1為樣品吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.9.2 ABTS陽離子自由基清除活性

將7 mmol/L的2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）-乙醇溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫避光條件下反應12 h后作為ABTS母液備用。將ABTS母液用無水乙醇稀釋至其在734 nm波長處吸光度為0.7±0.02，以此作為工作液。實驗中固定玉米醇溶蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，在10 mL玉米醇溶蛋白溶液中添加400 μL多酚溶液（1 mg/mL）得到復合物備用。取100 mL復合物樣品與3.9 mL ABTS工作液混合30 s后，避光反應8 min，利用紫外-可見分光光度計測定其在波長734 nm處的吸光度，ABTS陽離子自由基清除率按式（7）[10]計算：

式中：A1為樣品吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

由圖1可知，玉米醇溶蛋白的最大發(fā)射波長為304 nm，主要是由玉米醇溶蛋白的酪氨酸殘基產(chǎn)生[19]。當復合體系中3種多酚的含量逐漸增加時，玉米醇溶蛋白的內(nèi)源熒光強度逐漸降低，最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，表明兩者之間發(fā)生了相互作用，這可能是由于玉米醇溶蛋白與多酚之間發(fā)生熒光猝滅，蛋白分子三級結(jié)構(gòu)舒展，同時多酚的芳香環(huán)可與玉米醇溶蛋白的酪氨酸殘基結(jié)合，芳香族氨基酸殘基微環(huán)境的疏水性降低，致使玉米醇溶蛋白的內(nèi)源熒光猝滅。此外，對比3種不同結(jié)構(gòu)的多酚可知，TA致使玉米醇溶蛋白熒光強度下降幅度最大，其次為GA，最后為EGCG，這可能是TA分子質(zhì)量較大，與玉米醇溶蛋白的親和力更強，且TA的酚羥基含量較多，與玉米醇溶蛋白結(jié)合強度大于另外2 種多酚[20]。

圖1 玉米醇溶蛋白與3種多酚非共價復合物熒光發(fā)射圖譜Fig. 1 Fluorescence emission spectra of non-covalent complexes of zein and three polyphenols

2.2 熒光猝滅類型分析

當?shù)鞍踪|(zhì)作為熒光基團，多酚作為猝滅劑時，蛋白質(zhì)的熒光猝滅可分為2 種類型：一是為靜態(tài)猝滅，即為蛋白與多酚形成非熒光絡合物，二是為動態(tài)猝滅，蛋白質(zhì)與多酚發(fā)生動態(tài)碰撞使熒光猝滅[21]。在圖1中，隨著復合體系溫度的升高，玉米醇溶蛋白的內(nèi)源熒光均出現(xiàn)降低趨勢，表明溫度對玉米醇溶蛋白與多酚的結(jié)合有明顯的影響，可以利用Stern-Volmer方程，進一步分析熒光猝滅類型。由圖2可知，3種多酚與玉米醇溶蛋白間的Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV及速率猝滅常數(shù)Kq（Kq=KSV/τ0）。如表1所示，在25、30 ℃和35 ℃三個溫度下，3種多酚的猝滅常數(shù)KSV逐漸增大，玉米醇溶蛋白與TA在不同溫度下的Kq分別為3.27×1013（25 ℃）、3.31×1013（30 ℃）、3.33×1013L/（mol·s）（35 ℃）；玉米醇溶蛋白與EGCG復合體系的Kq分別為0.17×1013（25 ℃）、0.18×1013（30 ℃）、0.20×1013L/（mol·s）（35 ℃）；玉米醇溶蛋白與GA復合體系的Kq分別為0.15×1013（25 ℃）、0.18×1013（30 ℃）、0.22×1013L/（mol·s）（35 ℃），3種多酚與玉米醇溶蛋白結(jié)合形成復合物的速率猝滅常數(shù)均大于動態(tài)猝滅中的最大碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/（mol·s），此結(jié)果與熒光圖譜最大波長紅移結(jié)果一致。一般情況下動態(tài)猝滅只是影響猝滅分子的激發(fā)態(tài)，而不會改變猝滅物質(zhì)的吸收光譜[22]，因此在3種多酚與玉米醇溶蛋白的猝滅機制中均為靜態(tài)猝滅占主導地位，多酚與玉米醇溶蛋白之間形成復合物。

表1 不同溫度下3種結(jié)構(gòu)多酚對玉米醇溶蛋白的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants of three polyphenols for zein at different temperatures

圖2 玉米醇溶蛋白與3種多酚非共價復合物的Stern-Volmer曲線Fig. 2 Stern-Volmer curves of non-covalent complexes of zein and three polyphenols

2.3 結(jié)合位點及結(jié)合常數(shù)

玉米醇溶蛋白與多酚的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點可根據(jù)熒光強度ln（F0-F）/F對lnC的線性關系（圖3）求得。如表2所示，玉米醇溶蛋白與多酚的結(jié)合常數(shù)在107L/mol左右，表明兩者之間能形成穩(wěn)定的復合物。隨著復合體系溫度的升高，玉米醇溶蛋白與TA及EGCG結(jié)合常數(shù)逐漸降低，表明玉米醇溶蛋白與TA及EGCG是通過氫鍵結(jié)合，發(fā)生放熱反應，而玉米醇溶蛋白與GA結(jié)合常數(shù)逐漸升高，表明玉米醇溶蛋白與GA是通過疏水相互作用結(jié)合，為吸熱反應，在Cheng Jing等[23]的報道中同樣發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白與花青素-3-O-糖苷的結(jié)合主要通過疏水相互作用，并且它們之間的結(jié)合過程為放熱。由表2可知，玉米醇溶蛋白與3種多酚的結(jié)合位點數(shù)值（n）在1左右，表明蛋白質(zhì)與多酚大約是按照1∶1的物質(zhì)的量比結(jié)合。從25～35 ℃，玉米醇溶蛋白與TA結(jié)合位點下降幅度最大，表明溫度對玉米醇溶蛋白與TA結(jié)合形成復合物的穩(wěn)定性影響最大，這可能是由于升溫破壞玉米醇溶蛋白與TA非共價相互作用。

表2 不同溫度下3種多酚與玉米醇溶蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點Table 2 Binding constants and number of binding sites of three polyphenols to zein at different temperatures

圖3 3種多酚與玉米醇溶蛋白相互作用的雙對數(shù)曲線Fig. 3 Double logarithmic plots of the interactions between three polyphenols and zein

2.4 熱力學參數(shù)

通過Van’t Hoff公式計算可得到相應的熱力學參數(shù)，從而進一步判斷蛋白與多酚間的相互作用力類型。一般氫鍵及范德華力作用體系ΔH＜0、ΔS＜0，疏水作用力的體系ΔH＞0、ΔS＞0，靜電相互作用的體系ΔH≈0、ΔS＞0[24-25]。根據(jù)圖4及表3可知，3種多酚與玉米醇溶蛋白結(jié)合形成復合物后，其ΔG＜0，表明兩者之間的反應均為自發(fā)反應，玉米醇溶蛋白與TA及EGCG結(jié)合過程均為放熱反應，升高溫度不利于兩者之間的有效結(jié)合，而玉米醇溶蛋白與GA結(jié)合過程為吸熱反應，升溫有利于兩者間結(jié)合。玉米醇溶蛋白與TA及EGCG結(jié)合過程中ΔH＜0、ΔS＜0，表明兩者之間作用力主要是氫鍵相互作用，玉米醇溶蛋白與GA結(jié)合過程中ΔH＞0、ΔS＞0，表明兩者之間作用力主要是疏水相互作用。

表3 3種多酚與玉米醇溶蛋白復合物在不同溫度下相互作用的熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the interactions between three polyphenols and zein at different temperatures

圖4 3種多酚與玉米醇溶蛋白在不同溫度下相互作用的熱力學參數(shù)Fig. 4 Thermodynamic parameters of the interactions between three polyphenols and zein at different temperatures

2.5 紫外光譜的測定

如圖5所示，玉米醇溶蛋白在波長210 nm及278 nm處均存在一個明顯的吸收峰，其中在波長210 nm處的吸收峰主要由玉米醇溶蛋白的多肽骨架結(jié)構(gòu)C＝O產(chǎn)生，波長278 nm處的吸收峰由蛋白質(zhì)中含共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸殘基產(chǎn)生[15,22]。在玉米醇溶蛋白醇溶體系引入多酚后，在波長280 nm處的吸光度增大，且隨著多酚添加量的增加，峰值呈上升趨勢且發(fā)生輕微藍移。吸光度的這種變化表明多酚的加入改變了蛋白質(zhì)發(fā)色團周圍的微環(huán)境，玉米醇溶蛋白分子中的色氨酸和酪氨酸殘基中的芳香雜環(huán)疏水基團暴露[26]。結(jié)果表明玉米醇溶蛋白與多酚在醇溶體系存在相互作用，且多酚的引入可改變玉米醇溶蛋白的三級結(jié)構(gòu)。此外，在圖5中玉米醇溶蛋白與EGCG在波長280 nm左右的紫外吸收峰強度明顯低于玉米醇溶蛋白與TA及GA的吸收峰，這可能是EGCG的分子質(zhì)量較小，所含酚羥基數(shù)量較TA少，且分子剛性較強，導致其不易與蛋白質(zhì)分子結(jié)合。而在相同的質(zhì)量濃度條件下，GA可與玉米醇溶蛋白結(jié)合的分子數(shù)量比EGCG多，相互作用較強。

圖5 3種結(jié)構(gòu)多酚與玉米醇溶蛋白相互作用復合物的紫外光譜圖Fig. 5 UV spectra of complexes of three polyphenols with zein

2.6 玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒的外觀形貌及濁度

如圖6所示，玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒溶液呈現(xiàn)淡藍色，這可能是由于玉米醇溶蛋白獨特分子結(jié)構(gòu)及自組裝特性[27]。在圖6a中，隨著TA濃度的增加，樣品溶液顏色逐漸加深，樣品透光率由96.82%逐漸下降到30.25%，表明樣品濁度逐漸增加，出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于較多的TA與玉米醇溶蛋白發(fā)生相互作用導致復合顆粒粒徑發(fā)生變化或顆粒發(fā)生聚集[27]，而在圖6b和6c中，樣品溶液的濁度并未發(fā)生明顯改變，這可能是由于在相同物質(zhì)的量下，EGCG及GA的分子質(zhì)量較小，玉米醇溶蛋白與其結(jié)合并未在宏觀條件下發(fā)生明顯變化。從3種多酚與玉米醇溶蛋白結(jié)合形成復合物濁度的研究結(jié)果可知，玉米醇溶蛋白與TA發(fā)生非共價相互形成復合物且結(jié)合強度大于另外2 種多酚。多酚的結(jié)構(gòu)及分子質(zhì)量是影響玉米醇溶蛋白與多酚結(jié)合的主要因素，對比于另外2 種多酚，TA相對分子質(zhì)量為1 701.2，所含酚羥基數(shù)量較多，且具有更大的分子柔性，因此更易與玉米醇溶蛋白形成復合物。

圖6 玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒外觀形貌及濁度Fig. 6 Appearance and turbidity of zein and polyphenol composite colloidal particles

2.7 玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒粒徑、電位及微觀結(jié)構(gòu)

由圖7a可知，隨著TA的引入，復合膠粒的粒徑明顯大于玉米醇溶蛋白自組裝形成的顆粒粒徑（56.94 nm），并且隨著TA濃度的增加，復合膠體顆粒的粒徑由58.45 nm逐漸增大291.56 nm，電位絕對值由15.40 mV逐漸增大到18.33 mV（圖7b）。結(jié)果表明玉米醇溶蛋白與TA通過非共價結(jié)合發(fā)生相互作用，這可能是由于TA濃度增大使復合體系的pH值降低，玉米醇溶蛋白遠離等電點帶正電，玉米醇溶蛋白的表面電荷增加，從而使膠粒間的靜電排斥作用增強。由圖7c、d可知，EGCG的添加可使復合膠粒顆粒的粒徑減小，并且隨著EGCG濃度的增加，粒徑及電位均呈現(xiàn)降低趨勢。EGCG為多合配體，其不同的酚基可與玉米醇溶蛋白的不同位點相結(jié)合導致玉米醇溶蛋白粒徑減小，表面電荷降低，靜電排斥作用減弱。在圖7e、f中，GA與玉米醇溶蛋白結(jié)合后，復合顆粒的粒徑隨GA濃度的增加呈先增大后減小，電位呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。

圖7 玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒粒徑、PDI及電位Fig. 7 Particle sizes, polydisperse indexes and potentials of zein and polyphenol composite colloidal particles

由納米顆粒微觀形貌圖（圖8）可知玉米醇溶蛋白與多酚復合膠粒顆粒為粒徑較小且分散性較好的球形粒子，此結(jié)果與其水溶液的多分散相指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）結(jié)果一致。隨著TA濃度的增加，納米粒子間的交聯(lián)作用逐漸增大，而玉米醇溶蛋白與EGGC及GA的膠體顆粒并未出現(xiàn)明顯的交聯(lián)現(xiàn)象，這可能是由于TA所含酚羥基數(shù)量較多且分子具有一定的柔性，可視為一種多位點交聯(lián)劑，而EGCG分子質(zhì)量較小，雖然也具有一定的分子柔性，但其交聯(lián)作用弱于TA。GA苯環(huán)分子結(jié)構(gòu)上具有3個酚羥基，但是其結(jié)構(gòu)整體剛性較強，且其中的空間位阻有礙于玉米醇溶蛋白與其通過非共價相互作用結(jié)合，因此GA不易與玉米醇溶蛋白發(fā)生交聯(lián)形成復合物[28]。

圖8 玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒微觀結(jié)構(gòu)Fig. 8 Microstructure of zein and polyphenol composite colloidal particles

2.8 玉米醇溶蛋白與多酚復合物熱穩(wěn)定性

通過差示掃描量熱法可以了解多酚與玉米醇溶蛋白結(jié)合后對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響。由圖9可知，玉米醇溶蛋白在72.05 ℃出現(xiàn)代表蛋白質(zhì)熱變性溫度的一個吸熱峰，并且玉米醇溶蛋白與多酚結(jié)合后蛋白質(zhì)的變性溫度逐漸增大，表明多酚的引入會提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。其中TA與玉米醇溶蛋白結(jié)合使蛋白質(zhì)的熱變性溫度提高了22.36 ℃，明顯高于另外2 種多酚（EGCG與玉米醇溶蛋白結(jié)合熱變性溫度提高了11.35 ℃；GA與玉米醇溶蛋白結(jié)合熱變性溫度提高了14.40 ℃），這可能是TA與玉米醇溶蛋白發(fā)生了較強的相互作用使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而提高了蛋白質(zhì)的熱變性溫度。

圖9 玉米醇溶蛋白及其與3種多酚復合物的熱穩(wěn)定性Fig. 9 Thermal stability of zein and complexes of three polyphenols with zein

2.9 玉米醇溶蛋白與多酚復合物抗氧化性分析

由圖10可知，玉米醇溶蛋白本身不具備抗氧化活性，隨著多酚的添加，玉米醇溶蛋白與多酚形成復合物，使其具備一定的抗氧化活性，然而多酚本身的抗氧化活性受到抑制[10]，這是由于玉米醇溶蛋白通過反溶劑法形成膠粒，多酚的部分酚羥基被包覆于膠體內(nèi)部不能與自由基結(jié)合，同時，已有部分酚羥基與蛋白發(fā)生相互作用，降低了其與自由基碰撞的幾率，導致玉米醇溶蛋白-多酚復合物的抗氧化性低于游離多酚[29]。玉米醇溶蛋白與GA形成復合物對ABTS陽離子自由基清除率高于另外2 種多酚，這可能是由于GA與玉米醇溶蛋白結(jié)合較弱，水溶液中存在更多的游離GA，樣品溶液表現(xiàn)為更強的抗氧化能力。復合物的抗氧化活性增加可使后期研究玉米醇溶蛋白與多酚復合膠體顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的抗氧化性得到提高，延長其保質(zhì)期。

圖10 玉米醇溶蛋白及其與3種多酚復合物的抗氧化性Fig. 10 Antioxidant activity of zein and complexes of three polyphenols with zein

3 結(jié) 論

本研究利用簡單方法使玉米醇溶蛋白與多酚通過非共價相互作用方式形成復合物，對比3種含有不同數(shù)量鄰三元酚結(jié)構(gòu)單元的多酚對蛋白質(zhì)物理化學性質(zhì)及玉米醇溶蛋白膠體顆粒表面特性的影響。結(jié)果表明多酚引入可與玉米醇溶蛋白酪氨酸殘基結(jié)合使蛋白質(zhì)熒光猝滅，玉米醇溶蛋白與3種多酚可通過氫鍵及疏水相互作用以物質(zhì)的量比為1∶1結(jié)合形成復合物，相互作用均為自發(fā)反應（ΔG＜0），從而改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)，顯著提高蛋白質(zhì)的抗氧化性。玉米醇溶蛋白與TA相互作用后可使玉米醇溶蛋白膠粒的粒徑增大，粒子間能形成交聯(lián)作用，而玉米醇溶蛋白與EGCG及GA之間的結(jié)合較弱，其分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)對玉米醇溶蛋白膠體顆粒的表面特性影響較小，此研究結(jié)果對玉米醇溶蛋白及多酚在食品體系的開發(fā)和利用增加了新的可能性。