彭如潔 曾慶新 邱鋒 彭孝緯

(1福建醫(yī)科大學福建省老年醫(yī)院教學醫(yī)院消化內科，福建 福州 350003；2福建省立醫(yī)院消化病研究所)

胃癌是世界上癌癥相關死亡的第二大常見原因〔1，2〕。離子轉運蛋白在癌細胞中的作用是研究的熱點，并且已經在消化系統腫瘤中發(fā)現了各種類型的離子轉運蛋白〔3，4〕。氯離子胞內通道(CLIC)蛋白是哺乳動物細胞內新型陰離子通道的組成成分或調控因子。迄今為止，已經確定了7個不同的CLIC成員：CLIC1、CLIC2、CLIC3、CLIC4、CLIC5、p64和parchorin〔5〕。這些基因在其羧基末端具有高度同源性。就其體外分子功能而言，顯然所有CLIC蛋白和無脊椎動物CLIC樣蛋白均以可溶性球狀蛋白和具有離子通道活性的整合膜蛋白存在。在大多數情況下，這兩種形式之間的轉變受pH和氧化還原條件的影響〔6〕。CLIC4也稱為p64H1、RS43或mtCLIC，是CLIC家族的七個成員之一。CLIC4由253個氨基酸構成，蛋白分子量為29 kD，主要定位在線粒體上，此外在細胞核、高爾基體、內質網、微絲、細胞膜等部位亦有表達。CLIC4在腦、肝和皮膚等組織中表現出特別高的表達水平〔7〕。CLIC4具有抑制鱗癌的作用，并且CLIC4的減少程度與鱗狀腫瘤從良性進展到惡性直接相關〔8〕。沉默CLIC4基因可促進U251細胞的自噬，并啟動含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)相關線粒體途徑的凋亡〔9〕。本研究旨在探討RNA干擾沉默CLIC4基因對胃癌細胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞系SGC-7901(腺癌)和MGC-803(腺癌)購自中國科學院(中國上海)的上海細胞庫(http：//www.cellbank.org.cn)。使用Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco，美國)加入10%的胎牛血清(FBS,HyClone，美國)培養(yǎng)細胞，使用青霉素G(100 U/ml,Sigma，美國)和鏈霉素(100 μg/ml,Sigma，美國)雙抗處理。細胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)。

1.2實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)檢測 Trizol法提取總mRNA，取2 μg mRNA反轉錄合成cDNA，建立PCR體系，檢測mRNA表達水平。CLIC4上游引物序列：5′-GACAAAGAGCCCCTCATCGA-3′，下游引物5′-GTTTCCAATGCTTTCACC-ATC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物：5′-CAACGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物：5′-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′。

1.3siRNA合成和細胞轉染測定 針對CLIC4的四種人siRNA(GenePharma，中國上海)。一種與人、小鼠或大鼠基因序列無顯著序列相似性的陰性隨機siRNA(GenePharma，中國上海)用作陰性對照。CLIC4 siRNA和對照siRNA的序列為：siRNA1：CLIC4-Homo-131(正義鏈：5′-GAGCUUGUGUUGUG-CUGAATT-3′，反義鏈：5′-UUCAGCACAACAC-AAGCUCTT-3′)；siRNA2：CLIC4-Homo-630(正義鏈：5′-CAGCACUCAAUGACAAUCUTT-3′，反義鏈：5′-AGAUUGUCAUUGAGUGCUGTT-3′)；siRNA3：CLI-C4-Homo-805(正義鏈：5′-GCCAAAGUUACACAU-AGUATT-3′，反義鏈：5′-UACUAUGUGUAACUUUGGCTT-3′)；siRNA4：CLIC4-Homo-1195(正義鏈：5′-GGACAACAUAUUUCAGUAATT-3′，反義鏈：5′-UUA-CUGAAAUAUGUUGUC-CTT-3′)；和陰性隨機siRNA 5(正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。

分別將SGC-7901和MGC-803細胞系分為7組，分別為siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、siRNA4組、siRNA5組、模擬組(Mock組)和陰性對照組(CTRL組)。其中Mock組僅添加轉染試劑，CTRL組添加非靶向對照siRNA和轉染試劑，其余5組分別添加5種不同的CLIC4 siRNA和轉染試劑。對于細胞轉染，將細胞接種在96孔板(5×103細胞用于SGC-7901和3×103細胞用于MGC-803)和6孔板(5×105細胞用于SGC-7901和3×105細胞用于MGC-803)在含有10%FBS的DMEM中，附著24 h，然后每孔分別用5 pmol和100 pmol siRNA處理。將等摩爾量的siRNA與來自Invitrogen(Madison，WI，美國)的Lipofectamine2000轉染試劑一起孵育，將轉染的細胞在37℃下完全培養(yǎng)基上孵育6 h。細胞在試驗前分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。

1.4Western印跡 每孔蛋白上樣量50 μg，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳2 h后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%牛血清白蛋白封閉后，然后將膜與CLIC4特異性抗體(ABCAM；1∶1 000)和β-actin(ABCAM；1∶1 000)在4℃下孵育過夜。二抗(KPL；1∶5 000)室溫孵育1 h。使用Odyssey(美國)的雙色紅外激光成像分析儀系統通過光密度分析來量化條帶的密度。

1.5細胞生長和活力測定 通過四甲基偶氮噻藍(MTT)比色法測定CLIC4特異性siRNA對細胞活力的影響。將細胞接種在96孔板中，分為3組，分別為siRNA3組、Mock組和CTRL組。轉染siRNA 24 h、48 h和72 h后測定細胞活力。然后向每個孔中加入20 μl MTT(PBS原液中10 mg/ml，用培養(yǎng)基稀釋至1 mg/ml的工作濃度)并孵育4 h。除去培養(yǎng)基后，向每個孔中加入200 μl二甲基亞砜并輕搖10 min。在酶標儀上以570 nm波長記錄吸光度。CLIC4 siRNA對細胞生長抑制的影響評估為細胞存活率百分比。

1.6細胞周期分析和膜聯蛋白V染色試驗 對于流式細胞術細胞周期分析，收集用siRNA處理的細胞，用PBS洗滌，在冷的70%乙醇中固定，并在4℃下儲存直至染色。固定后，用PBS洗滌細胞，并與100 μl RNaseA在37℃溫育30 min，然后用400 μl碘化丙啶染色。使用來自BioVision的膜聯蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測早期和晚期的凋亡細胞。洗滌后，將細胞重懸于500 μl膜聯蛋白V結合緩沖液中，然后加入5 μl膜聯蛋白V-FITC和5 μl碘化丙啶。將樣品在室溫下在黑暗中溫育5 min并使用流式細胞術分析。

1.7細胞遷移試驗 使用聚碳酸酯膜細胞培養(yǎng)插入皿測量細胞通過過濾器遷移能力。轉染后24 h，用胰蛋白酶消化細胞。使用具有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜的細胞培養(yǎng)插入皿?？椎缀?%FBS的培養(yǎng)基(0.5 ml)，而將模擬、陰性對照或CLIC4 siRNA轉染的細胞(1.0×106/ml懸浮于0.1 ml含0.5%FBS的培養(yǎng)基中)接種到上孔中并孵育24 h在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。刮去表面上的剩余細胞。然后洗滌膜，固定并用甲基紫染色。顯微鏡計數已遷移到過濾器下側的細胞來確定細胞的遷移能力。

1.8基質膠侵襲試驗 使用涂有基質膠的聚碳酸酯膜孔板進行基質膠侵襲試驗。SGC-7901細胞密度為3.0×105/ml，MGC-803為1.5×105/ml。其他處理方法與細胞遷移試驗相同。

1.9統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、Student-Newman-Keuls檢驗。

2 結 果

2.1CLIC4在胃癌細胞中的表達 人胃癌細胞系SGC-7901和MGC-803中均存在CLIC4 mRNA。見圖1。

圖1 CLIC4在胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803中的表達

2.2CLIC4表達下調抑制胃癌細胞中CLIC4蛋白和mRNA的表達 在不同時間點，SGC-7901和MGC-803細胞系的siRNA5組、Mock組和CTRL組的CLIC4蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，但此3組的CLIC4蛋白表達顯著高于siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組和siRNA4組(P<0.05)，其中siRNA3組的蛋白表達水平最低(P<0.05)。見圖2，圖3，表1。

1～7：siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、siRNA4組、siRNA5組、Mock組、CTRL組;圖3同

圖3 MGC-803細胞系轉染相關siRNA 24 h、48 h、72 h后CLIC4蛋白表達

表1 SGC-7901、MGC-803、中的CLIC4蛋白相對表達水平

在不同時間點，SGC-7901和MGC-803細胞系的siRNA5組、Mock組和CTRL組的CLIC4 mRNA表達無顯著差異(P> 0.05)，但此3組的CLIC4 mRNA表達顯著高于siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組和siRNA4組(P<0.05)，其中siRNA3組的mRNA表達水平最低(P<0.05)。見表2。因此，選擇CLIC4 siRNA3用于后續(xù)的體外試驗。

表2 SGC-7901、MGC-803中的CLIC4 mRNA相對表達水平

2.3CLIC4敲低促進體外胃癌細胞的生長 siRNA3組的SGC-7901細胞系在24、78及72 h的吸光度顯著高于Mock組和CTRL組(P<0.05)，而Mock組和CTRL組的吸光度無顯著差異(P>0.05)。siRNA3組的MGC-803細胞系在24、48及72 h的吸光度顯著高于Mock組和CTRL組(P<0.05)，而Mock組和CTRL組的吸光度無顯著差異(P>0.05)，見表3。表明siRNA3敲低CLIC4可促進體外胃癌細胞的生長。

表3 SGC-7901和MGC-803細胞系的平均吸光度

2.4CLIC4表達下調誘導胃癌細胞中的細胞周期停滯 兩種細胞系的siRNA3組的G2/M期比例顯著高于Mock組和CTRL組，而G0/G1期和S期比例顯著低于Mock組和CTRL組(P<0.05)。見表4。

表4 SGC-7901和MGC-803細胞系的細胞周期分布

2.5CLIC4表達下調在體外抑制胃癌細胞凋亡 SGC-7901和MGC-803細胞系siRNA3組的凋亡率〔(8.9±1.1)%,(9.0±1.5)%〕均顯著低于Mock組〔(25.5±3.5)%,(20.4±2.6)%〕和CTRL組〔(23.8±3.2)%,(19.5±3.8)%,均P<0.05〕。

2.6CLIC4表達下調抑制胃癌細胞的體外遷移和侵襲 siRNA3組在兩種胃癌細胞系中的侵襲、遷移細胞數顯著低于Mock組和CTRL組(P<0.05)，見圖4、表5。表明抑制CLIC4敲低顯著抑制SGC-7901和MGC-803細胞的侵襲和遷移能力。

圖4 CLIC4敲低對SGC-7901和MGC-803細胞48 h細胞遷移和侵襲的影響(結晶紫，染色×200)

表5 胃癌細胞系的受侵襲細胞數和平均遷移細胞數個)

3 討 論

胃癌是一種高度侵襲性和致命的惡性腫瘤，占全球所有新發(fā)癌癥病例的8.6%，是癌癥相關死亡的第二大原因〔10〕。手術是局部胃癌的標準治療方法，但遠處轉移或復發(fā)的晚期患者仍無法治愈〔11，12〕。與鄰近的正常組織相比，腫瘤組織中的CLIC4表達增加1.95倍〔13，14〕。CLIC4表達增加與淋巴結轉移、淋巴和神經周圍侵襲、病理分期和不良生存率密切相關。

本研究發(fā)現兩種細胞系中的抑制率不同，可能原因是兩種細胞系之間不同的細胞生長特征和組織來源。

本研究結果表明siRNA3對CLIC4的下調促進了胃癌細胞的增殖；CLIC4參與了G2/M期細胞周期的調控，并在細胞分裂過程中發(fā)揮了重要作用。

有學者發(fā)現CLIC4的過表達顯著增加細胞活力，CLIC4的敲低顯著抑制細胞遷移和侵襲〔15〕。本研究結果表明siRNA3下調CLIC4表達明顯抑制了體外培養(yǎng)的SGC-7901和MGC-803細胞的侵襲和遷移能力。研究解釋了CLIC4如何促進癌細胞的運動，發(fā)現CLIC4與改變細胞黏附有關〔16〕。整合素對癌細胞的侵襲和轉移至關重要，是細胞黏附分子的主要家族，介導細胞-細胞黏附或細胞-細胞外基質黏附，影響信號轉導、細胞增殖、分化、存活和凋亡〔17〕。通過增加β1、α3和αvβ3的表面表達，CLIC4表達的下調可以增加內皮細胞與細胞外基質的黏附，并通過阻止細胞與細胞外基質的接觸來抑制運動。整合素表達的這些變化也為細胞生長和活力缺陷提供了可能的解釋〔18〕。此外，研究證實胃癌的侵襲和遷移與整合素密切相關〔19〕。