周輝 張國艷 肖開提·乃斯如拉

(新疆喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院麻醉科，新疆 喀什 844000)

宮頸癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，其具有較高的發(fā)病率且患病人群趨于年輕化，而宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者治療失敗的重要原因〔1,2〕。腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡等生物學(xué)特性也可參與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程〔3〕。因而針對腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移尋找宮頸癌治療藥物有助于提高治療效果。阿片類藥物可影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程，還可能影響患者預(yù)后〔4〕。研究表明舒芬太尼作為一種阿片類鎮(zhèn)痛藥物可影響肝癌細(xì)胞增殖及凋亡〔5〕。相關(guān)報道指出長鏈非編碼RNA(LncRNA)AWPPH在膀胱癌、乳腺癌、肝癌中表達上調(diào)，并可促進細(xì)胞的惡性增殖及遷移侵襲〔6～8〕。本研究觀察了不同濃度的舒芬太尼處理SiHa細(xì)胞后對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，并初步探討其對AWPPH的調(diào)控作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 舒芬太尼購自人福醫(yī)藥集團股份公司(批號：1180620)。宮頸癌SiHa細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。AWPPH小干擾RNA(si-AWPPH)、亂序無意義陰性對照序列(si-NC)、AWPPH過表達載體(pcDNA3.1-AWPPH)及陰性對照(pcDNA3.1)購自廣州銳博生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；噻唑藍(MTT)、細(xì)胞凋亡試劑盒購自日本同仁研究所；Transwell小室、基質(zhì)膠購自美國BD公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體均購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗購自美國AAT Bioquest公司。

1.2實驗處理與分組 宮頸癌SiHa細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞，用不同濃度(0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.04 μg/ml)的舒芬太尼處理細(xì)胞〔9〕。實驗分組：con組(正常培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞)、舒芬太尼0.01 μg/ml組(0.01 μg/ml的舒芬太尼處理細(xì)胞24 h)、舒芬太尼0.02 μg/ml組(0.02 μg/ml的舒芬太尼處理細(xì)胞24 h)、舒芬太尼0.04 μg/ml組(0.04 μg/ml的舒芬太尼處理細(xì)胞24 h)。后續(xù)實驗為驗證舒芬太尼是否可通過調(diào)控AWPPH的表達而發(fā)揮作用，實驗分組：舒芬太尼0.04+pcDNA3.1組(pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞48 h，0.04 μg/ml的舒芬太尼處理細(xì)胞24 h)、舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH組(pcDNA3.1-AWPPH轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞48 h，0.04 μg/ml的舒芬太尼處理細(xì)胞24 h)。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中AWPPH的表達水平 提取各組SiHa細(xì)胞總RNA，合成cDNA后進行qRT-PCR，采用2-ΔΔCt法計算AWPPH相對表達量。

1.4MTT檢測細(xì)胞增殖 各組SiHa細(xì)胞分別于作用24 h、48 h、72 h后，按試劑盒說明加入MTT溶液，最后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值(OD)，計算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白組-實驗組)/空白組×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組SiHa細(xì)胞，按照試劑盒說明書操作，最后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 遷移：上室加入200 μl單細(xì)胞懸液(5×104個/孔)，下室加入含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定后用0.1%結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲：用基質(zhì)膠包被Transwell小室上室，其余步驟同遷移實驗。

1.7Western印跡檢測CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、Bax、E-cadherin蛋白表達 提取各組SiHa細(xì)胞總蛋白，變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入CyclinD1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)、MMP-2(1∶800)、Bax(1∶500)、E-cadherin(1∶500)一抗稀釋液，4℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h，顯影，分析各條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1舒芬太尼對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的影響 用不同濃度的舒芬太尼處理宮頸癌SiHa細(xì)胞，結(jié)果顯示，與con組相比，舒芬太尼0.01 μg/ml組、舒芬太尼0.02 μg/ml組、舒芬太尼0.04 μg/ml組SiHa細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2相對表達量降低，而Bax相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中舒芬太尼0.04 μg/ml作用效果較為顯著，見圖1、表1、圖2。

圖1 舒芬太尼處理后SiHa細(xì)胞凋亡

表1 舒芬太尼對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的影響

1～4:con組、舒芬太尼0.01 μg/ml組、舒芬太尼0.02 μg/ml組、舒芬太尼0.04 μg/ml組；圖4同

2.2舒芬太尼對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與con組相比，舒芬太尼0.01 μg/ml組、舒芬太尼0.02 μg/ml組、舒芬太尼0.04 μg/ml組SiHa細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目減少，MMP-2相對表達量降低，E-cadherin相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表2、圖4。

圖3 舒芬太尼對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 舒芬太尼對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.3舒芬太尼對SiHa細(xì)胞中AWPPH表達的影響 與con組相比，舒芬太尼0.01 μg/ml組、舒芬太尼0.02 μg/ml組、舒芬太尼0.04 μg/ml組SiHa細(xì)胞中AWPPH mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 舒芬太尼對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲及AWPPH表達的影響

2.4抑制AWPPH對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-AWPPH組SiHa細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2相對表達水平明顯降低(P<0.05)，Bax、E-cadherin相對表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖5、表3、表4、圖6。

圖6 抑制AWPPH對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表3 抑制AWPPH對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

表4 抑制AWPPH對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

圖5 抑制AWPPH對SiHa細(xì)胞凋亡的影響

2.5過表達AWPPH能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與舒芬太尼0.04+pcDNA3.1組相比，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH組SiHa細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率明顯降低，CyclinD1、Bcl-2相對表達量明顯升高，Bax相對表達量明顯降低(P<0.05)，見圖7、表5、表6、圖8。

圖7 過表達AWPPH能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對SiHa細(xì)胞凋亡的影響

1～4：con組，舒芬太尼0.04 μg/ml組，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1組，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH組；圖9同

表5 過表達AWPPH能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表6 過表達AWPPH能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達及遷移、侵襲的影響

2.6過表達AWPPH能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的作用 與舒芬太尼0.04+pcDNA3.1組相比，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH組SiHa細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)明顯增多，MMP-2相對表達量明顯升高，E-cadherin相對表達量明顯降低(P<0.05)，見表6、圖9。

圖9 過表達AWPPH能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

舒芬太尼是一種新型的阿片類鎮(zhèn)痛藥，作用于μ阿片受體，研究表明舒芬太尼可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10〕。舒芬太尼還可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達從而誘導(dǎo)大鼠肝癌瘤細(xì)胞凋亡〔11〕。相關(guān)報道指出舒芬太尼可有效緩解宮頸癌患者術(shù)后的應(yīng)激反應(yīng)〔12〕。本研究結(jié)果顯示，舒芬太尼可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。研究表明CyclinD1在宮頸癌中呈高表達，并可促進細(xì)胞周期進程，促進細(xì)胞增殖〔13〕。Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，Bax在腫瘤中呈高表達并可促進細(xì)胞凋亡〔14〕。本研究結(jié)果提示舒芬太尼可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜從而促進腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可增強腫瘤細(xì)胞侵襲能力，其中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達下調(diào)可促進EMT〔15〕。本研究結(jié)果說明舒芬太尼抑制宮頸癌細(xì)胞黏附力作用機制與E-cadherin、MMP-2蛋白有關(guān)。

AWPPH在結(jié)腸癌細(xì)胞中呈高表達，下調(diào)AWPPH的表達可通過下調(diào)葡萄糖輕運蛋白(GLUT)-1的表達而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖〔16〕。AWPPH通過調(diào)控miR-93-3p/FZD7分子軸及激活Wnt/β-catenin途徑而促進骨肉瘤進展〔17〕。研究表明AWPPH表達水平升高可促使非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)〔18〕。本研究結(jié)果顯示不同濃度的舒芬太尼處理后宮頸癌細(xì)胞中AWPPH的表達水平顯著降低，進一步抑制AWPPH表達后可減弱宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，促進細(xì)胞凋亡。為驗證舒芬太尼是否可通過調(diào)控AWPPH的表達而抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，本研究將AWPPH過表達載體轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞，隨后使用舒芬太尼處理，結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低，而遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)增多，提示舒芬太尼可能通過下調(diào)AWPPH影響宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，舒芬太尼可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，并可促進細(xì)胞凋亡，其作用機制與抑制AWPPH的表達有關(guān)，為進一步研究舒芬太尼對宮頸癌細(xì)胞的作用機制奠定理論基礎(chǔ)，可為治療宮頸癌提供新方向。