張維新 劉紅 石志堅 程亞麗

(鄭州市中醫(yī)院心內科，河南 鄭州 450007)

心血管疾病是嚴重威脅人類健康的疾病，動脈粥樣硬化(AS)是心血管疾病的病理基礎〔1〕。內皮細胞凋亡是內皮損傷的主要形式，在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔2〕。氧化性低密度脂蛋白(OX-LDL)可介導內皮細胞氧化應激和凋亡相關信號通路，導致內皮細胞損傷，促進AS的發(fā)生發(fā)展〔3〕。因此，探討影響OX-LDL誘導的內皮細胞凋亡的分子機制可為AS的預防和治療提供新途徑。MCM3AP-AS1是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)，對多種疾病的發(fā)生發(fā)展起調控作用。研究顯示，MCM3AP-AS1參與調控膠質瘤〔4〕、肝癌〔5〕等腫瘤細胞的惡性行為；MCM3AP-AS1 在骨關節(jié)炎中表達上調，其通過靶向 miR-142-3p引起HMGB1表達的上調，進而促進軟骨細胞凋亡，加劇骨關節(jié)炎的發(fā)展進程〔6〕。然而，MCM3AP-AS1在內皮細胞損傷的影響還未知。

生物信息學軟件預測顯示，MCM3AP-AS1可能靶向調控miR-205-5p的靶基因，神經(jīng)生長調節(jié)因子(NEGR)1可能是miR-205-5p的靶基因。研究顯示，miR-205-5p可靶向抑制HMGB1的表達減輕缺血再灌注誘導的腦組織氧化應激和炎癥反應，改善腦缺血再灌注損傷〔7〕；過表達miR-25-5p可通過靶向下調NEGR1表達進而抑制OX-LDL誘導的人腦微血管內皮細胞(HBMECs)凋亡〔8〕。目前，MCM3AP-AS1能否靶向miR-205-5p/NEGR1影響血管內皮細胞損傷也還未知。本研究主要探討了MCM3AP-AS1對OX-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖和凋亡的影響，并以miR-205-5p/NEGR1軸為切入點，探討了MCM3AP-AS1影響OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 HUVEC細胞購自中國科學院上海細胞庫；四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Sigma公司)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(北京索萊寶)；LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司)；miR-205-5p模擬物(mimics)、MCM3AP-AS1小干擾RNA(si-MCM3AP-AS1)、NEGR1的小干擾RNA(si-NEGR1)和過表達載體(pcDNA-NEGR1)、模擬對照序列(miR-con)、小干擾RNA陰性對照序列(si-con)、空載體(pcDNA-con，廣州銳博生物科技有限公司)；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(日本TAKARA公司)；PCR引物，上海生工；NEGR1抗體(中國Abcam公司)；細胞周期蛋白(Cyclin)D1和活化的半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3抗體(北京中杉)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染 復蘇HUVEC細胞，加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)，置于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取2.5 ml對數(shù)期HUVEC細胞(2.5×104個/ml)接種于6孔板中，當細胞融合至60%時，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別轉染si-MCM3AP-AS1、si-NEGR1、si-con、miR-205-5pmimics、miR-con、pcDNA-con、pcDNA-MCM3AP-AS1、共轉染miR-205-5p mimics與pcDNA-con、miR-205-5p mimics與pcDNA-MCM3AP-AS1、si-MCM3AP-AS1與pcDNA-NEGR1、si-MCM3AP-AS1與pcDNA-con至HUVEC細胞。轉染12 h后，更換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞分組 HUVEC細胞分為OX-LDL組(用含10 mg/L〔9〕OX-LDL的培養(yǎng)基干預48 h)和對照組(NC組，用不含OX-LDL的培養(yǎng)基干預48 h)。轉染si-con、si-MCM3AP-AS1、si-NEGR1、miR-205-5pmimics、miR-con、共轉染si-MCM3AP-AS1與pcDNA-NEGR1、si-MCM3AP-AS1+pcDNA-con的HUVEC細胞均用含10 mg/L OX-LDL的培養(yǎng)基干預48 h，并分別記為OX-LDL+si-con組、OX-LDL+si-MCM3AP-AS1組、OX-LDL+si-NEGR1組、OX-LDL+miR-205-5p組、OX-LDL+miR-con組、OX-LDL+si-MCM3AP-AS1+pcDNA-NEGR1組、OX-LDL+si-MCM3AP-AS1+pcDNA-con組。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞中MCM3AP-AS1、miR-205-5p和NEGR1mRNA表達 取2.5 ml HUVEC細胞或轉染后的細胞(2.5×104個/ml)均接種于6孔板中，培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，按照上述1.2.2分組處理。培養(yǎng)后，收集各組細胞，用Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA后，進行PCR反應。反應程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物序列：MCM3AP-AS1上游5′-GTGCCCAGTA GCCGATG-3′，下游5′-CGTGCGATGACAGTCG AT-3′；miR-205-5p上游5′-TGCGAAAGTC CGTGAACGG-3′，下游5′-AGGTACCGATAGCAGTGAT-3′；NEGR1上游5′-TGGGCAGCAA CGACCGATGA-3′，下游5′-GTACGATAGTCATAGT CTAAC-3′；U6上游5′-GGGCCGATGAAAATGCAGAG-3′，下游5′-CCAGAAGCCATGATGATCT-3′；GAPDH上游5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。2-△△Ct法分別計算MCM3AP-AS1和NEGR1mRNA相對GAPDH、miR-205-5p相對U6的表達量。

1.2.4Western印跡法檢測細胞中NEGR1、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達 細胞接種和培養(yǎng)同1.2.3。用RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白含量后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用5 %脫脂牛奶封閉1 h。于4℃冰箱中分別用NEGR1(1∶600)、CyclinD1(1∶400)、Cleaved-caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶500)一抗孵育過夜。洗膜后，置于辣根過氧化酶標記的二抗(1∶2 000)中37℃孵育1 h。加顯影液，避光顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析目的蛋白相對β-actin的表達量。

1.2.5MTT檢測細胞增殖 取200 μl HUVEC細胞或轉染后的細胞(2.5×104個/ml)接種于96孔板中，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基。按照上述1.2.2分組處理后，每孔加20 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標儀490 nm處測吸光度(A)值。實驗重復3次。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞接種和培養(yǎng)同1.2.3，收集各組細胞。用PBS清洗后，加500 μl結合緩沖液，重懸細胞。加10 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)，室溫避光孵育10 min。加5 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光反應5 min，上流式細胞儀檢測。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗 由上海捷瑞生物工程有限公司分別合成含有miR-205-5p結合位點的MCM3AP-AS1的核苷酸序列及NEGR1的3′非翻譯區(qū)(UTR)，并插入pGL3-Promoter質粒載體中，構建MCM3AP-AS1野生型重組質粒(WT-MCM3AP-AS1)和NEGR1野生型重組質粒(WT-NEGR1)。利用定點突變技術將結合位點突變后，插入pGL3-Promoter質粒載體中，MCM3AP-AS1突變型重組質粒(MUT-MCM3AP-AS1)和NEGR1突變型重組質粒(MUT-NEGR1)。取2.5 ml對數(shù)期HUVEC細胞(2.5×104個/ml)接種于6孔板中，當細胞融合至60%時，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別將WT-MCM3AP-AS1(或MUT-MCM3AP-AS1)與miR-205-5pmimic(或miR-con)，WT-NEGR1(MUT-NEGR1)與miR-205-5pmimic(或miR-con)共轉染至HUVEC細胞。轉染12 h后，更換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h后，收集細胞。利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗，方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1OX-LDL對HUVEC細胞中MCM3AP-AS1、miR-205-5p和NEGR1的表達的影響 OX-LDL組HUVEC細胞中MCM3AP-AS1、NEGR1 mRNA和蛋白的表達量均高于NC組(P<0.05)，而miR-205-5p表達量低于NC組(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 OX-LDL誘導HUVEC細胞后MCM3AP-AS1、NEGR1 和miR-205-5p表達水平

圖1 Western印跡檢測NEGR1蛋白表達

2.2下調MCM3AP-AS1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響 OX-LDL組HUVEC細胞存活率和CyclinD1蛋白表達量均明顯低于NC組(P<0.05)，而MCM3AP-AB1水平、細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達量均明顯高于NC組(P<0.05)。OX-LDL+si-MCM3AP-AS1組HUVEC細胞存活率和CyclinD1蛋白表達量均明顯高于OX-LDL+si-con組(P<0.05)，MCM3AP-AS1水平、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達量均明顯低于OX-LDL+si-con組(P<0.05)。見圖2、圖3，表2。

表2 下調MCM3AP-AS1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響

圖2 Western印跡檢測CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達

圖3 流式細胞儀檢測下調MCM3AP-AS1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡的影響

2.3下調NEGR1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響 OX-LDL+si-NEGR1組HUVEC細胞存活率和CyclinD1蛋白表達量均高于OX-LDL+si-con組(P<0.05)，凋亡率、NEGR1和Cleaved-caspase-3蛋白表達量均低于OX-LDL+si-con組(P<0.05)。見表3，圖4，圖5。

圖4 流式細胞儀檢測下調NEGR1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡的影響

圖5 Western印跡檢測NEGR1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 下調NEGR1 對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響

2.4上調miR-205-5p對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響 OX-LDL+miR-205-5p組miR-205-5p水平、HUVEC細胞存活率和CyclinD1蛋白表達量均高于OX-LDL+miR-con組(P<0.05)，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達量均低于OX-LDL+miR-con組(P<0.05)。見圖6，圖7，表4。

圖6 流式細胞儀檢測上調miR-205-5p對OX-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡的影響

圖7 Western印跡檢測上調miR-205-5p對OX-LDL誘導的HUVEC細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

表4 上調miR-205-5p對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響

2.5MCM3AP-AS1靶向miR-205-5p Starbase生物信息學軟件預測顯示的MCM3AP-AS1與miR-205-5p的結合位點見圖8。共轉染W(wǎng)T-MCM3AP-AS1與miR-205-5p的HUVEC細胞熒光素酶活性為(0.25±0.03)，顯著低于共轉染W(wǎng)T-MCM3AP-AS1與miR-con的HUVEC細胞(1.00±0.10，t=21.551，P<0.05)；共轉染MUT-MCM3AP-AS1與miR-205-5p的HUVEC細胞熒光素酶活性為(1.04±0.13)，與共轉染MUT-MCM3AP-AS1與miR-con的HUVEC細胞熒光素酶活性(1.08±0.12)比較無顯著變化(t=0.678，P>0.05)。si-MCM3AP-AS1組miR-205-5p表達量為(2.69±0.27)，顯著高于si-con組的(1.00±0.14，t=16.670，P<0.05)。

圖8 starbase對miR-205-5p和MCM3AP-AS1結合進行預測示意圖

2.6miR-205-5p靶向調控NEGR1表達 Starbase生物信息學軟件預測顯示的NEGR1 3′UTR與miR-205-5p的結合位點見圖9。共轉染W(wǎng)T-NEGR1與miR-con、WT-NEGR1與miR-205-5p的HUVEC細胞熒光素酶活性分別為(1.00±0.10、0.38±0.04)，兩者比較差異顯著(t=177.459，P<0.05)；共轉染MUT-NEGR1與miR-con、MUT-NEGR1與miR-205-5p的HUVEC細胞熒光素酶活性分別為(1.10±0.12、1.15±0.13)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.006，P>0.05)。miR-205-5p組NEGR1蛋白水平(0.14±0.01)顯著低于miR-con組(0.42±0.04，t=20.373，P<0.05)，見圖10。

圖9 NEGR1的3′UTR含有與miR-205-5p核苷酸序列互補的結合位點

圖10 Western印跡檢測NEGR1 的表達

2.7上調NEGR1逆轉下調MCM3AP-AS1對HUVEC細胞增殖和凋亡的影響 OX-LDL+si-MCM3AP-AS1+pcDNA-NEGR1組HUVEC細胞存活率和CyclinD1蛋白表達量均低于OX-LDL+si-MCM3AP-AS1+pcDNA-con組(P<0.05)，而細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達量均高于OX-LDL+si-MCM3AP-AS1+pcDNA-con組(P<0.05)。圖11，圖12，見表5。

圖11 上調NEGR1逆轉下調MCM3AP-AS1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響

圖12 Western印跡檢測NEGR1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表5 上調NEGR1逆轉下調MCM3AP-AS1對OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

血管內皮細胞是血管內膜的保護屏障，其受損或功能障礙可導致血管內膜的通透性增加，造成內膜功能紊亂，引發(fā)動脈粥樣硬化〔10〕。OX-LDL可使炎性細胞黏附于內皮，造成內皮細胞釋放大量細胞因子，引起斑塊破裂及血栓的形成，是血管內皮細胞損傷的關鍵因素之一〔11〕。本研究結果與相關研究報道結果一致〔12〕，說明OX-LDL可阻礙HUVEC細胞增殖，并促進其凋亡。

近年來，隨著對lncRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。Tao等〔13〕研究顯示，lncRNA CASC11通過下調IL-9和調節(jié)血管平滑肌細胞的凋亡和增殖改善動脈粥樣硬化。作為一種lncRNA，MCM3AP-AS1參與腫瘤、骨關節(jié)炎等多種疾病的發(fā)展進程〔14～16〕。本研究結果說明下調MCM3AP-AS1能夠促進OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖，并抑制其凋亡，提示MCM3AP-AS1有可能成為減輕血管內皮細胞損傷的分子靶點。

本研究證實了MCM3AP-AS1在HUVEC細胞中靶向結合并負調控miR-205-5p的表達。研究顯示，過表達miR-205-5p可通過靶向下調HMGA2的表達進而抑制高糖誘導的人腎系膜細胞炎癥、細胞外基質積累和氧化應激，miR-205-5p/HMGA2軸參與糖尿病腎病的發(fā)展進程〔17〕。本研究結果提示miR-205-5p有可能成為減輕血管內皮細胞損傷的分子靶點。

此外，本研究證實了NEGR1是miR-205-5p的靶基因。NEGR1是一種細胞黏附因子，已有研究顯示，下調NEGR1表達可抑制內皮細胞的凋亡〔8〕，與本研究OX-LDL可促進HUVEC細胞中NEGR1表達，下調NEGR1表達可促進OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖并抑制細胞凋亡的結果一致。本研究進一步提示下調MCM3AP-AS1通過靶向miR-205-5p進而下調NEGR1的表達來促進OX-LDL誘導的HUVEC細胞增殖及抑制細胞凋亡。