陳尚 王超 王昊 張星霖 鄭飛波 袁勝利 陳潤芝 石德道

(1青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266000；2開封市中心醫(yī)院；3湖北省腫瘤醫(yī)院)

近年來甲狀腺腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，其中最常見的是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)〔1〕。PTC具有惡性程度低預(yù)后生存率高的特點，但分化程度高早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點為臨床治療帶來了一定困難。大部分手術(shù)切除的PTC患者需終生服藥，術(shù)后給予放射性I131治療對身體副作用較大。近年來生物學(xué)靶向基因治療成為該領(lǐng)域的研究熱點。甲狀腺癌的發(fā)生是由多種因素共同作用的結(jié)果。膜聯(lián)蛋白(Annexin)是一類在單核細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞等多種細胞中發(fā)現(xiàn)的Ca2+依賴性膜磷脂結(jié)合蛋白家族，其中AnnexinA2是重要的家族成員之一〔2〕。AnnexinA2在肝癌、肺癌和胃癌等多種腫瘤存在異常高表達，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞侵襲遷移、增殖和凋亡等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔2～5〕。研究表明AnnexinA2在PTC中呈現(xiàn)高表達，與腫瘤的浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性〔6〕。AnnexinA2在PTC細胞中的作用機制尚不清楚。本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染沉默PCT K1細胞中AnnexinA2基因，觀察基因沉默后細胞侵襲、遷移能力的變化，并進一步探討其可能的作用機制，為PTC分子生物治療的提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 PTC、甲狀腺良性腫瘤和正常組織標(biāo)本各20例均來青島市市立醫(yī)院2016年10月至2018年3月PTC患者，每種組織類型男女各10例，年齡18～63歲。術(shù)后經(jīng)病理證實為PTC和甲狀腺良性腫瘤，標(biāo)本置于-80℃保存。本實驗研究標(biāo)本的采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實驗試劑與儀器 NC-siRNA和AnnexinA2-siRNA(上海吉瑪基因有限公司)，兔抗人AnnexinA2單克隆抗體和β-catenin抗體(英國Abcam公司)，兔抗人c-myc、細胞周期蛋白(cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和GAPDH抗體(美國CST公司)，山羊抗兔(lgG)二抗和Western印跡檢測試劑盒(上海碧云天有限公司)，噻唑藍(MTT)試劑盒和基質(zhì)膠(美國BD公司)，Transwell小室(美國Corning 公司)，SYBR Green qPCR Master Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，Trizol RNA提取試劑、AnnexinA2、MMP-2、MMP-9引物和轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000(美國 Invitrogen公司)。qRT-PCR儀器(中國香港Gene Company Limited)，倒置高分辨率熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad 公司)，AI600凝膠成像系統(tǒng)(美國GE Healthcare 公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) PTCK1 細胞由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院贈予，K1細胞采用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640，置于37℃、5%CO2細胞孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.3.2細胞轉(zhuǎn)染 采用lipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染法。取處于傳代次數(shù)在5代以內(nèi)且處于對數(shù)生長期的K1細胞，將細胞以5×105/孔數(shù)量均勻接種于6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達到50%～70%融合度時進行轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000說明書將人工合成的NC-siRNA和AnnexinA2-siRNA分別轉(zhuǎn)入siRNA-NC組和siRNA-AnnexinA2組，空白對照組無任何處理。6～8 h后換液，10%FBS的RPMI1640常規(guī)培養(yǎng)，進一步采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和Western印跡評估細胞轉(zhuǎn)染的干擾效果。各組設(shè)置3～5個復(fù)孔，平行實驗3次。

1.3.3沉默AnnexinA2基因?qū)毎鹠RNA表達量的影響 采用qRT-PCR法。按Trizol法進行操作提取細胞總RNA，驗證純度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行PCR擴增。擴增條件為：95℃ 預(yù)變性15 s，95℃ 變性30 s，60℃ 30 s，72℃ 延伸40 s，40個循環(huán)。引物AnnexinA2序列：5′-AAATGTCTACTGTTCACGAAATCC-3′(正義鏈)和5′-TAGTCGGGCTTCAGTCAGT-3′(反義鏈)。引物β-catenin序列：5′-TCTGACCTGATGGAGTTGAG-3′(正義鏈)和5′-CTTACTTGCTCATGCGTGGA-3′(反義鏈)。引物c-myc序列：5′-TGTAGTAATTCCAGCGAGAG-3′(正義鏈)和5′-CGCAGATTGTAAGTTCCAG-3′(反義鏈)。引物cyclinD1序列：5′-CAGTAGTGCGAAGCATAGGAGA-3′(正義鏈)和引物5′-GATGCACGAGTAGTCGAGTAG-3′(反義鏈)。引物MMP-2序列：5′-AGAGCTGGCCTAGTGATGACT-3′(正義鏈)和5′-GCGCATGGTCTCGATGGTTC-3′(反義鏈)。引物MMP-9序列：5′-CATGGACATCGTCATCCACT-3′(正義鏈)和5′-ACATTGGCCTTGGAAGATCG-3′(反義鏈)。引物內(nèi)參GAPDH序列：5′-GGGCGCCTGGTCACCAGGGCTG-3′(正義鏈)和5′-GGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3′(反義鏈)。每組設(shè)置5個復(fù)孔，實驗平行進行3次。

1.3.4沉默AnnexinA2基因?qū)毎鞍妆磉_水平的影響 采用Western印跡。待細胞密度達到85%～95%時，收集各組細胞采用蛋白提取試劑盒提取細胞總的蛋白，蛋白定量后變性(100℃，5 min)，置于-80℃保存待用。蛋白量40 μg/泳道上樣，凝膠電泳成功后，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，新鮮脫脂奶粉封閉1 h，分別加入配制的一抗稀釋液。室溫12 h，洗膜后分別加入二抗，置于室溫2 h，加入顯色劑，采用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯色。以GAPDH為內(nèi)參，計算各組蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.3.5沉默AnnexinA2對細胞增殖能力的影響 采用MTT比色法。轉(zhuǎn)染成功后，取100 μl細胞懸液(3×104/100 μl)均勻接種于96孔板中，孔板四周邊緣加入100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72、96 h，換液后加入10 μl MTT稀釋液，吹打均勻后置于37℃恒溫箱反應(yīng)4 h，清除培養(yǎng)基，各孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)。震蕩反應(yīng)15 min后，在酶標(biāo)儀490 nm波長下測吸光度(OD)，OD值代表細胞的增殖活性。各組設(shè)6個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次，計算結(jié)果取平均值。

1.3.6沉默AnnexinA2對細胞侵襲能力的影響 采用Transwell小室法。首先制備Transwell侵襲小室，按照基質(zhì)膠按照說明書用培養(yǎng)基進行比例(1∶3)稀釋，每孔取基質(zhì)膠稀釋液均勻涂抹于上室，于細胞超凈臺紫外線燈下照射4 h備用。轉(zhuǎn)染成功后，采用不含有FBS的培養(yǎng)基將同等條件下轉(zhuǎn)染成功的細胞制備成單細胞懸液，取200 μl的細胞懸液(2×103/200 μl)均勻接種于小室的上室，下室中加入600 μl的10%～15%FBS RPMI1640，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。48 h后，清除上室，將小室4%多聚甲醛固定30 min，HE染色。實驗重復(fù)3次。于倒置顯微鏡下觀察穿透的細胞數(shù)，隨機選取5個視野/組，取平均值。

1.3.7沉默AnnexinA2對細胞遷移能力的影響 采用Transwell小室法。其余步驟依次按照細胞的侵襲試驗進行。于倒置顯微鏡(200倍)下觀察穿膜的細胞數(shù)，隨機選取5個視野/組，取平均值。平行實驗重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1AnnexinA2在PTC組織中的表達 與甲狀腺良性腫瘤組織(0.218)和正常組織(0.193)相比，PTC組織中AnnexinA2 mRNA(0.982)的相對表達量較高(P<0.05)，而甲狀腺正常組織和甲狀腺良性腫瘤組織之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染細胞的干擾效果

2.2.1細胞中AnnexinA2 mRNA的表達量 轉(zhuǎn)染K1細胞后，AnnexinA2 mRNA的相對表達量分別是：空白對照組(1.000±0.000)、siRNA-NC組(0.934±0.042)、siRNA-AnnexinA2組(0.356±0.056)，siRNA-AnnexinA2組中AnnexinA2 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)；siRNA-NC組和siRNA-AnnexinA2組無顯著性差異(P>0.05)；表明小干擾RNA瞬時轉(zhuǎn)染有效地降低K1細胞中AnnexinA2 mRNA的表達水平。

2.2.2細胞AnnexinA2蛋白的表達量 細胞轉(zhuǎn)染后，AnnexinA2蛋白的相對表達量分別為：空白對照組(0.976±0.073)、siRNA-NC組(0.953±0.059)、siRNA-AnnexinA2組(0.253±0.034)，與空白對照組和siRNA-NC組相比，siRNA-AnnexinA2組中AnnexinA2蛋白的相對表達水平明顯降低(P<0.05)，空白對照組和siRNA-NC組無顯著差異(P>0.05)；表明AnnexinA2-siRNA轉(zhuǎn)染可以顯著抑制K1細胞的AnnexinA2蛋白的表達。見圖1。

圖1 Western印跡檢測細胞中AnnexinA2蛋白的相對表達

2.3細胞增殖活性的變化 細胞轉(zhuǎn)染成功后，MTT法檢測不同時間段(24、48、72、96 h)細胞的增殖活性，與空白對照組和siRAN-NC組相比，siRNA-AnnexinA2組細胞OD值降低(P<0.05)，表明AnnexinA2-siRNA可以抑制K1細胞的增殖活性。見表1。

表1 各組各時間段細胞OD值比較

2.4細胞遷移和侵襲能力的變化 體外細胞遷移結(jié)果示：與空白對照組、siRNA-NC組比較，siRNA-AnnexinA2組穿透的細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，空白對照組和siRNA-NC組無顯著性差異(P>0.05)。體外細胞侵襲結(jié)果示：與空白對照組和siRNA-NC組相比，siRNA-AnnexinA2組細胞穿透基質(zhì)膠的數(shù)明顯減低(P<0.05)，空白對照組和siRNA-NC組無顯著性差異(P>0.05)。見圖2、圖3、表2。

圖3 Transwell小室法檢測細胞侵襲(HE，×200)

表2 各組細胞穿膜數(shù)比較個，n=6)

2.5細胞中c-myc、cyclinD1、β-catenin、MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表達 與空白對照組和siRNA-NC組相比，siRNA-AnnexinA2組細胞中c-myc、cyclinD1、β-catenin、MMP-2和MMP-9蛋白和mRNA的相對表達均明顯降低(均P<0.05)；而空白對照組和siRNA-NC組無顯著性差異(均P<0.05)。表明細胞轉(zhuǎn)染成功后可以有效地抑制Wnt/β-catenin 信號通路蛋白及其下游侵襲相關(guān)蛋白的表達。見圖4、表3。

圖4 蛋白免疫印跡法檢測細胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的相對表達

3 討 論

小干擾siRNA是一種基因阻斷的技術(shù)，它通過特異性地敲除或部分敲除目的基因的表達水平，在靶基因干擾的探索研究中得到廣泛認可〔7〕。體外合成siRNA主要通過RNA鏈的5′端磷酸化而發(fā)揮活性，它的每一個位點在識別基因靶序列的過程中往往具有高度的特異性，從而達到目的基因有效地沉默〔8，9〕。目前通過小干擾RNA進行靶基因干擾的腫瘤生物學(xué)治療已經(jīng)成為研究的熱點。

AnnexinA2是膜聯(lián)蛋白家族中分子量為36 kD的蛋白質(zhì)〔10〕。在AnnexinA2一般包括3個不同的功能區(qū)：N末端區(qū)域，C末端區(qū)域和核心區(qū)；其中N末端區(qū)域中主要包括組織纖溶酶原活化劑(tPA)和鈣結(jié)合蛋白S100/A10(P11)〔11〕。AnnexinA2與細胞表面的纖溶酶原和組織纖溶酶原激活物結(jié)合，導(dǎo)致纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。在金屬蛋白酶的激活中，纖溶酶作為絲氨酸蛋白酶在細胞外基質(zhì)成分的降解中發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔12〕。甲狀腺癌在女性腫瘤中排名第五位〔13〕，主要分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌四種病理類型，其中乳頭狀癌最為常見，雖預(yù)后良好但早期易發(fā)生多發(fā)淋巴結(jié)浸潤甚至遠處轉(zhuǎn)移。近年來有關(guān)PTC基因靶向治療成為研究的熱點。研究表明〔14～16〕AnnexinA2在結(jié)直腸癌、前列腺癌和肝癌等多種腫瘤存在異常表達，與腫瘤的微環(huán)境有著密切的關(guān)系，在癌癥的進展中發(fā)揮著協(xié)同的作用。研究證實AnnexinA2基因在PTC組織中是新型的生物學(xué)標(biāo)志物，是PTC早期發(fā)病和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志性蛋白之一〔6，17〕。

在腫瘤中，MMPs通過降解細胞外基質(zhì)(ECM)屏障，參與調(diào)控腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力〔18〕。MMP-2、9是MMPs重要的酶，主要作用是使腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移的能力從而浸潤周圍的組織〔19〕。在PTC中MMP-2和MMP-9存在異常高表達，是腫瘤發(fā)生的重要標(biāo)志性蛋白，且與腫瘤的浸潤程度和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)〔20～23〕。在PTC中，細胞周期蛋白cyclinD1與細胞周期G1有關(guān)，c-myc在甲狀腺癌呈現(xiàn)高表達，c-myc 和cyclinD1是與腫瘤增殖活性密切相關(guān)的蛋白〔24，25〕。研究表明 Wnt/β-catenin信號通路參與多種腫瘤進展中細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而 β-catenin是Wnt信號通路中關(guān)鍵因子，在PTC中與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系〔26，27〕。本研究表明沉默AnnexinA2基因后可以抑制細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，下調(diào)c-myc、cyclinD1、MMP-2和MMP-9的表達水平，其機制可能通過Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)的。

本研究表明通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小干擾RNA可特異性敲除K1細胞中AnnexinA2的表達，并且Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力，AnnexinA2基因極有可能是PTC新的候選靶點，從而為臨床早期診斷和生物學(xué)靶向治療研究提供理論基礎(chǔ)。有關(guān)AnnexinA2基因在PTC中腫瘤微環(huán)境、細胞增殖分化和信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有待于進一步研究。