趙士博 吳忠港 張藝馨 謝開仁 于雪瀅 鄭淮遠(yuǎn) 潘智 黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；3廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

高血壓是世界范圍內(nèi)的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問題〔1～3〕。高血壓多由遺傳因素引起，但其病因尚未明確〔4〕。有統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，長期飲酒人群患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)大于普通人。長期飲酒造成高血壓的同時(shí)，也為肝臟帶來不同程度損傷。我國目前高血壓發(fā)病率仍呈上升趨勢，且高血壓可引發(fā)心腦血管等疾病，嚴(yán)重影響人們的健康和生活質(zhì)量〔5〕。高血壓可導(dǎo)致的肌纖維化與心室僵硬，是嚴(yán)重的心血管危險(xiǎn)因素〔5～7〕，肝有很高的再生潛能〔8〕，如何在臨床治療中對(duì)飲酒致高血壓合并肝損傷進(jìn)行更有效的治療或早期預(yù)防十分重要。本研究選用普通級(jí)小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立飲酒致高血壓合并肝損傷的病變模型。以便于進(jìn)一步研究飲酒致高血壓合并肝損傷的發(fā)病機(jī)制、臨床治療方案及防治方法。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 OLYMPUS BX51透反兩用研究系統(tǒng)顯微鏡〔奧林巴斯(中國)有限公司〕；Thermo ScientificTMHistoStarTM組織包埋機(jī)(賽默飛世爾科技中國有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日立7600-series)；YLS-1A多動(dòng)能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；ALC-NIBP無創(chuàng)傷血壓測量分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；ALC-HTP動(dòng)物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；JSC電子天平秤CN-BH；JY0127-91條形盒測力計(jì)(規(guī)格：10 N)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 牛欄山二鍋頭白酒62度5 L大桶裝(產(chǎn)品編號(hào)：Q/SYSHN0014)；清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司出品)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法與指標(biāo)檢測

1.3.1動(dòng)物分組與飼養(yǎng)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)小鼠100只，雌雄各半，體重30～45 g/只，周齡不詳，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。方法：小鼠依性別分為20籠(每籠5只隨機(jī)分組并標(biāo)號(hào))，24 h晝夜周期喂養(yǎng)。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，取雌雄各5籠共50只為對(duì)照組，正常食水喂養(yǎng)。其余50均采用自由飲酒法(乙醇體積分?jǐn)?shù)從5%逐漸遞增至25%)建立飲酒型高血壓模型小鼠。

1.3.2一般體征監(jiān)測 每天定時(shí)測定小鼠食量，每3 d測小鼠體重一次。每周測定自主活動(dòng)、抓力。每30 d測量血壓即收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均脈壓(MBP)，并記錄數(shù)據(jù)。(1)食量：每天定時(shí)稱量每籠小鼠食物總質(zhì)量，除以每籠小鼠個(gè)數(shù)，得到24 h內(nèi)每只小鼠食量。以周為單位計(jì)算每只小鼠周平均食量。(2)體重：每3 d稱小鼠體重，統(tǒng)計(jì)每只小鼠的體重變化情況。(3)自主活動(dòng)：采用多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀，將小鼠置于自主活動(dòng)儀內(nèi)預(yù)適應(yīng)10 min后，記錄10 min內(nèi)小鼠活動(dòng)次數(shù)，測定3次，取平均值。(4)抓力：采用彈簧測力計(jì)測定小鼠抓力，將小鼠置于鐵網(wǎng)上，待小鼠用力抓住鐵網(wǎng)時(shí)及時(shí)加力后拉，測到最大抓力，測定3次，取平均值。(5)血壓：睡眠血壓作為降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的治療目標(biāo)的作用尚不明確〔9〕，因此本研究選擇測量小鼠清醒時(shí)期的血壓。應(yīng)用ALC-NIBP無創(chuàng)傷血壓測量分析系統(tǒng)測定小鼠清醒時(shí)的血壓，并固定血壓測定的時(shí)間于下午三點(diǎn)進(jìn)行，避免因不同時(shí)間所帶來的干擾。測定血壓之前先打開預(yù)熱器加熱，控制室溫在25～30℃。檢測各通道氣密性，保證各通道正常工作。將小鼠裝入鼠籠，調(diào)節(jié)鼠籠松緊度并置于恒溫毯上預(yù)熱10 min。恒溫系統(tǒng)溫度控制在40～45℃。將小鼠鼠尾穿過固定器孔固定好后，將脈搏傳感器有感應(yīng)面(圓形小膠塊)的一面向上插入脈搏傳感器插孔，推至底部以保證傳感器位置正確，并在電腦中顯示出均勻穩(wěn)定的波動(dòng)后即可開始測定血壓。每30 d測定清醒狀態(tài)下小鼠SBP、DBP、MBP值。

1.4肝臟組織病理切片觀察 待小鼠SBP高于130 mmHg且保持穩(wěn)定后于模型組中隨機(jī)挑選4只小鼠頸椎脫臼處死，開腹取其肝臟組織，送至右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行切片制作，請(qǐng)病理科醫(yī)生進(jìn)行查看并給予病理診斷。

1.5肝功能指標(biāo)的測定 待小鼠SBP高于130 mmHg且病理切片明確反映肝損傷后，禁食12 h，眼球采血并分離血清，送至右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)的含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1食量 與對(duì)照組比較，模型組食量明顯下降。隨著飲酒周期與飲酒濃度的增加，食量變化幅度較大，且隨著時(shí)間推移模型組24 h攝入量整體呈下降趨勢。見表1。

2.2體重 與對(duì)照組比較，模型組體重波動(dòng)較大，后期下降明顯，與飲酒致食欲降低有關(guān)。見表1。

2.3自主活動(dòng) 與對(duì)照組比較，模型組自主活動(dòng)有明顯幅度的下降。隨飼養(yǎng)時(shí)間的增長，模型組自主活動(dòng)整體呈下降趨勢。見表1。

2.4抓力 隨造模時(shí)間的增長，模型組出現(xiàn)乏力疲倦，隨給酒濃度的上升，模型組逐漸出現(xiàn)下降趨勢。見表1。

表1 兩組造模不同時(shí)間食品、體重、自主活動(dòng)、抓力比較

2.5血壓 兩組造模60 d、72 d SBP、DBP顯著高于造模30 d(均P<0.01)。兩組間造模60 d、72 d SBP、DBP比較均存在顯著差異(均P<0.01)，且造模72 d差異更顯著。見表2。由于血壓范圍明顯超出正常值，提示高血壓模型小鼠復(fù)制可能已經(jīng)成功。

表2 兩組SBP、DBP、MBP比較

2.6病理切片 自由飲酒喂養(yǎng)72 d，模型組肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，脂肪變性伴細(xì)胞壞死，間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤，提示肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微炎癥。形態(tài)學(xué)檢查提示模型組肝臟出現(xiàn)病理性改變。見圖1。

圖1 模型組病理切片形態(tài)學(xué)(HE染色)

2.7肝功能檢測 模型組血清ALT和AST、ALP含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。兩組ALB無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。提示模型組小鼠出現(xiàn)肝損傷。

表3 兩組肝功能指標(biāo)

3 討 論

高血壓是引發(fā)心臟病和腦卒中的主要原因。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚〔10，11〕。酒精性肝損傷初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化〔12〕。目前飲酒人群中高血壓患病率高、危害大，過多的鈉鹽、低鉀飲食、飲酒過度、飽和脂肪酸攝入過量致使血壓升高，現(xiàn)今與高血壓有關(guān)的疾病死亡率和發(fā)病率正在上升〔13，14〕。高血壓作為世界上最常見的慢性病，長期飲酒在導(dǎo)致血壓升高的同時(shí)也會(huì)誘發(fā)肝臟疾病〔15，16〕。

在中國北方和寒冷地區(qū)的人群鹽攝入量高于南方和沿海地區(qū)，人群平均血壓及高血壓患病率也相應(yīng)較高〔17〕。生活中高血壓多以繼發(fā)性為主，不良生活方式誘發(fā)為多。酒性濕熱，過量飲酒導(dǎo)致濕熱酒毒積累傷脾，濕熱濁邪留于肝臟，日久濕聚成痰，痰濁、濕熱與血相互搏結(jié)停于肋下而形成痞塊、瘀停水阻，而大腹如鼓，發(fā)為“酒臌”。長期飲酒型高血壓證候特征表現(xiàn)為“納呆少食”“身重腫滿”“體倦乏力”。過量飲酒致使酒精堆積傷及肝臟〔18〕。故從飲食角度研究并建立高血壓動(dòng)物模型，對(duì)高血壓的預(yù)防和干預(yù)具有重要意義。

綜上，長期飲酒致高血壓可引起小鼠肝功能異常。單純飲酒誘導(dǎo)后隨著飲酒濃度的提升小鼠血壓升高明顯，持續(xù)、穩(wěn)定的提升飲酒濃度可加速小鼠高血壓造模，通過自由飲酒造?？傻玫椒€(wěn)定的高血壓小鼠模型，為治療飲酒致高血壓并改善肝臟損傷的藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)；為臨床針對(duì)長期飲酒致高血壓合并肝損傷病例的用藥、治療與深入研究提供思路。