李巖 張謹 張競男 閆思睿 馬艷華 薛昕 徐宋瑤 李麗 扈瑞平 薛慧婷

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學 1基礎醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2附屬醫(yī)院)

急性淋巴細胞白血病(ALL)是一種免疫表型高度異質(zhì)性的淋巴系統(tǒng)惡性克隆性疾病，是臨床上比較多發(fā)的白血病類型之一，ALL具有細胞突變快、易轉(zhuǎn)移、細胞凋亡率低、易復發(fā)等特點〔1〕。目前常用治療方法包括骨髓移植、誘導治療、免疫治療、聯(lián)合化療等〔2〕，由于多數(shù)化療藥物靶向殺傷腫瘤的能力有限，可能同時對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心腦血管等造成嚴重損害，因此，患者在接受治療的同時，往往會伴隨較大的不良反應，其中一些甚至致命。隨著化療的進行，機體容易對化療藥物產(chǎn)生耐受，增加疾病復發(fā)的風險〔3，4〕。因此，尋找高效、低毒、靶向性強的白血病治療或輔助治療藥物成為目前關注的焦點。肉蓯蓉蒙語名為查干告亞，屬于列當科、肉蓯蓉屬，寄生于沙漠樹木的根部，有“沙漠人參”的美譽〔5〕。主要產(chǎn)區(qū)為內(nèi)蒙古阿拉善盟，在新疆、甘肅等西北地區(qū)也有一定分布。肉蓯蓉的主要活性成分包括苯乙醇苷、木脂素、甜菜堿、甾醇、氨基酸及多糖等〔6～8〕，具有潤腸通便、補腎益精等作用，能提高性功能、抗疲勞、保肝、保護心臟、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用〔5，9，10〕。研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉多糖(CDP)作為其主要活性成分之一，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用〔11，12〕。張濤等〔13，14〕發(fā)現(xiàn)CDP對白血病細胞K562、THP-1具有顯著殺傷作用，并提示CDP在白血病預防或治療過程具有一定作用。此外，在針對治療急性白血病的中藥復方中，肉蓯蓉也作為重要組成成分之一而發(fā)揮作用。但肉蓯蓉的具體作用機制尚未知曉。本文研究分離純化CDP，探討CDP對人急性白血病細胞系Jurkat的殺傷作用及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 肉蓯蓉粉末購自內(nèi)蒙古宏魁蓯蓉集團有限責任公司，人急性白血病細胞系Jurkat購自上海細胞生物研究所細胞庫，噻唑藍(MTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、caspase-9、CD71、CD45、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，actin抗體購自上海碧云天生物技術有限公司，電化學發(fā)光(ECL)底物購自美國Thermo Scientific公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。GelView 6000 plus智能圖像工作站(廣州博鷺騰生物科技有限公司產(chǎn)品)，Revolve FL正倒置熒光顯微鏡(美國Echo Laboratories公司產(chǎn)品)，EPOCH酶標儀(北京伯騰儀器有限公司產(chǎn)品)。

1.2CDP分離純化 取肉蓯蓉粉末500 g，95%乙醇浸泡過夜，利用紗布過濾，收集濾渣，60℃熱水煮提，2 h/次，共3次。結(jié)束后，合并3次濾液，減壓濃縮至原體積2/3，加入3倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜。次日，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，Sevag法除蛋白，無水乙醇沉淀后，冷凍干燥得CDP〔15，16〕。

1.3細胞培養(yǎng) 人急性白血病細胞系Jurkat實驗室液氮中保存。使用時，37℃水浴鍋中迅速復蘇細胞，培養(yǎng)于10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中(含有100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)。在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代一次，待細胞進入對數(shù)生長期時，開展實驗。

1.4MTT實驗 取對數(shù)生長期的Jurkat細胞，離心獲得細胞沉淀，計數(shù)5×105個/ml。取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種100 μl細胞，再加入100 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基作為對照組；實驗組分為3組，先利用RPMI1640培養(yǎng)基配制不同濃度CDP，然后每孔加入100 μl Jurkat細胞和100 μl CDP溶液，使CDP最終濃度分別為1、2和5 mg/ml，每組設置5個復孔，于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。孵育結(jié)束后，每孔加入20 μl MTT(母液濃度為5 mg/ml)溶液，放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，最后加入100 μl 20% SDS 于37℃過夜溶解甲臜，次日利用酶標儀檢測各組570 nm處的吸光值，利用公式分別計算不同濃度CDP對Jurkat細胞增殖的抑制率。

1.5Western印跡 取對數(shù)生長期的Jurkat細胞，以2×105個/ml的密度接種于6孔板中，500 μl/孔，對照組加入500 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基。設置3個實驗組，分別為1、2和5 mg/ml多糖處理組，CDP提前溶解于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，于6孔板中加入500 μl細胞和500 μl 不同濃度CDP溶液，37℃條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，獲得細胞沉淀，利用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次。洗滌完畢后，每組加入20 μl細胞裂解液，于冰上裂解細胞30 min。提取總蛋白，采用Bradford〔17〕的方法調(diào)整細胞濃度。各組取20 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。利用脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗人caspase-3和caspase-9抗體，稀釋比例1∶1 000，室溫孵育1 h，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)搖床上漂洗3次(10 min/次)，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，利用PBST漂洗3次，PBS漂洗1次后，加入ECL底物，利用智能圖像工作站成像，對比各組條帶變化，研究CDP誘導Jurkat細胞凋亡作用。

對于凋亡通路相關蛋白的檢測，細胞培養(yǎng)及CDP處理條件同上，反應結(jié)束后裂解細胞進行蛋白定量。通過SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入抗CD71、CD45、p-JNK、p-ERK抗體(1∶1 000)，室溫孵育1 h，利用HRP標記的二抗(1∶1 000)繼續(xù)孵育1 h，最后利用智能圖像工作站成像，研究CDP誘導Jurkat細胞凋亡的相關信號分子。所得實驗條帶用Image J(1.8.0)進行灰度分析。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細胞增殖水平 成功分離得到CDP，其中糖含量大于90%，蛋白質(zhì)含量小于5%。1 mg/ml CDP組對細胞增殖的抑制率為(19.1±2.1)%，而2 mg/ml和5 mg/ml CDP組細胞增殖抑制率分別為(44.2±5.2)%和(47.8±4.4)%，說明CDP能夠顯著抑制Jurkat細胞的增殖，并呈劑量依賴性。

2.2細胞凋亡水平 與對照組(0.62±0.04、0.56±0.07)相比，5 mg/ml CDP處理Jurkat細胞后，導致caspase-9和caspase-3的酶原形式pro-caspase-9(0.09±0.02)和pro-caspase-3(0.12±0.01)大量減少，1 mg/ml和2 mg/ml CDP組對于細胞中pro-caspase-9(0.58±0.04、0.51±0.01)和pro-caspase-3含量(0.48±0.04、0.44±0.05)沒有明顯影響，即低濃度CDP不會誘導Jurkat細胞凋亡，以抑制細胞增殖為主，見圖1。

1～4：對照組、1 mg/ml CDP組、2 mg/ml CDP組、5 mg/ml CDP組；下圖同

2.3細胞凋亡受體 對照組CD71、CD45相對表達量為1.00±0.04、0.54±0.02。5 mg/ml CDP組能夠顯著抑制CD71(0.05±0.01)和CD45(0.13±0.03)的表達；1 mg/ml和2 mg/ml CDP組能夠一定程度抑制CD71(0.52±0.06、0.43±0.07)的表達，而對CD45(0.51±0.01、0.48±0.02)的表達沒有明顯作用。見圖2。

圖2 CDP對細胞膜表面受體表達影響

2.4凋亡相關通路 對照組p-JNK、p-ERK相對表達量分別為1.20±0.08、0.21±0.03。5 mg/ml CDP組誘導細胞凋亡的同時，顯著減少JNK的磷酸化水平(0.32±0.04)，顯著增加ERK的磷酸化水平(1.13±0.05)；1 mg/ml、2 mg/ml CDP對JNK磷酸化水平(1.12±0.06、1.06±0.06)沒有明顯影響，但是仍會增加ERK的磷酸化水平(0.54±0.04、0.63±0.02)。見圖3。

圖3 CDP對JNK和ERK磷酸化的影響

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)CDP對于白血病細胞系具有一定的抑制作用，但是具體的作用機制尚未知曉。

細胞凋亡發(fā)生的過程中，caspase-9是caspase依賴性凋亡過程中的上游信號分子之一，正常狀態(tài)下以酶原形式(pro-caspase)-9儲存在細胞中，當細胞受到凋亡信號刺激后，pro-caspase-9被大量水解，產(chǎn)生活化形式的cleaved-caspase-9，繼續(xù)向下傳遞凋亡信號，推動凋亡進程〔18〕。Caspase-3屬于效應型caspase分子，是細胞caspase依賴性凋亡過程中的關鍵信號分子，正常狀態(tài)下同樣以酶原形式(pro-caspase-3)存在，一旦被水解激活，產(chǎn)生大量cleaved-caspase-3，則會裂解細胞中多種關鍵蛋白分子，最終誘導細胞凋亡〔19〕。CDP屬于生物大分子活性多糖類物質(zhì)，不能自由通過細胞膜進入細胞，因此CDP誘導細胞凋亡作用是通過影響Jurkat細胞膜表面受體的表達和分布，進而將信號傳遞到細胞內(nèi)部，最終活化caspase家族蛋白，致使細胞最終發(fā)生凋亡。本研究說明低濃度CDP不會誘導Jurkat細胞凋亡，以抑制細胞增殖為主。

CD71又名轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，是參與鐵吸收和調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育的Ⅱ型跨膜糖蛋白受體，CD71在急性白血病患者體內(nèi)高表達，且與原發(fā)性耐藥相關，即CD71表達量越高，則首次化療效果越差。因此，CD71是輔助診斷的標志物之一〔20〕。CD45表達于所有類型白細胞表面，又名白細胞共同抗原，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，與T細胞發(fā)育分化密切相關。CD45在不同種類白血病中的表達量和變構類型各異，因此可作為白血病鑒別診斷與免疫分型標志之一〔21〕。CD45單克隆抗體已大量用于白血病尤其是耐藥型白血病的治療研究中，F(xiàn)riesen等〔22〕發(fā)現(xiàn)放射性核素標記CD45單抗可通過激活caspase家族蛋白(包括caspase-3、caspase-8、caspase-9)誘導耐藥白血病細胞株凋亡。CDP誘導Jurkat細胞凋亡，首先通過作用細胞膜表面受體CD45和CD71，影響二者的表達和分布，將凋亡信號傳遞到細胞內(nèi)，最終激活caspase-9和caspase-3，引發(fā)凋亡。然而，caspase-9和caspase-3均位于凋亡通路的下游，而上游信號分子需要進一步探討。本研究中CDP在濃度為5 mg/ml時，誘導Jurkat細胞凋亡，同時抑制CD45的表達，該作用與上述CD45單克隆抗體的作用類似。因此，從凋亡相關受體CD45與CD71的角度出發(fā)，CDP對于治療或者輔助治療白血病具有一定潛力。絲裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)(MAPKs)表達于所有真核細胞中，是介導胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至胞內(nèi)的十分重要的信息傳遞通路，由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，包括ERK、JNK和p38MAPK，其磷酸化與去磷酸化作為細胞生命活動的開關，參與并調(diào)控細胞生長、增殖、分化、活化及凋亡等過程〔23～25〕。本研究提示，JNK去磷酸化參與CDP誘導T細胞凋亡，而ERK磷酸化參與CDP抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的兩個過程。

綜上，CDP對T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat具有細胞毒性作用，表現(xiàn)為低濃度(2 mg/ml以下)抑制細胞增殖，而高濃度(5 mg/ml)誘導細胞凋亡。CDP誘導Jurkat細胞凋亡主要通過影響和改變細胞膜表面凋亡相關受體CD71與CD45的表達，將信號傳遞到細胞內(nèi)部，進一步引起ERK磷酸化和JNK去磷酸化，最終活化caspase-9，進而激活caspase-3導致細胞凋亡。