趙玉玲 黃 沂 周艷瓊 蔣菲菲 陳海燕

廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院護理部，廣西南寧 530023

神經(jīng)根型頸椎?。╟ervical spondylotic radiculopathy，CSR）是臨床上最常見的頸椎病，神經(jīng)病理性疼痛系其主要癥狀。神經(jīng)根受壓導致的神經(jīng)根損傷是CSR患者疼痛的主要原因[1]，神經(jīng)根損傷導致神經(jīng)細胞凋亡增多。如何降低細胞凋亡，修復神經(jīng)根損傷是治療CSR 關鍵。細胞自噬與神經(jīng)病理性疼痛顯著相關，調(diào)節(jié)細胞自噬可改善疼痛[2]。PI3K/Akt/mTOR 通路在細胞增殖與凋亡中起關鍵作用，是經(jīng)典的抗凋亡通路，Akt/mTOR 通路是細胞自噬重要的負性調(diào)控路徑[3]，激活該通路能減少細胞凋亡，促進受損神經(jīng)恢復，發(fā)揮對細胞的保護作用。前期實驗證實藥熨療法可降低CSR 大鼠自發(fā)性疼痛評分，提高機械痛閾值[4]，本研究基于Akt/mTOR 通路探討藥熨療法調(diào)節(jié)細胞自噬、減少細胞凋亡的機制，為藥熨療法的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取體重150～200 g 的4 周齡SPF 級SD 大鼠18 只（斯貝福生物技術有限公司），許可證號：SCXK（京）2019-0010，予溫度（23±2）℃、濕度60%、12 h 循環(huán)燈光、標準飼料、自由飲水，飼養(yǎng)7 d 適應環(huán)境，穩(wěn)定機能。隨機選取其中6 只作為空白組，其余建立CSR 模型。造模成功后，將其按隨機數(shù)字表法分為模型組、藥熨組，每組各6 只。對大鼠處置遵從實驗動物福利相關規(guī)定進行。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 RIPA 裂解液（北京索來寶公司，貨號：R0020）；ECL 發(fā)光試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：sc-2048）；PVDF 膜（Millipore 公司，貨號：IPVH00010）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZB2301、ZB2305）；p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B 抗體、β-actin（Affinity公司，貨號：AF0016、AF3308、AF5128、AF5402、AF7018）。

1.2.2 實驗儀器 低溫高速離心機（Eppendorf 公司，centrifuge5417R）；核酸蛋白定量儀DS-11（美國丹諾爾Denovix 超微量紫外可見分光光度計）；半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（ATTO 公司，WSE-4040、AE6675L）；透射電子顯微鏡（HITACHI公司，HT7700）；成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS 公司，UC90）。

1.3 造模方法

手術造模，造模大鼠禁食禁水12 h。采用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉后手術，將無毒、性質(zhì)穩(wěn)定的0.5 mm 直徑尼龍魚線插入SD 大鼠C6-T1 位置，建立CSR 模型，術后取頸部患處神經(jīng)根節(jié)進行HE染色，根據(jù)組織神經(jīng)元細胞核、胞質(zhì)及細胞形態(tài)結構判斷是否造模成功[5]。

1.4 干預方法

造模7 d 后，藥熨組開始藥熨治療，連續(xù)藥熨7 d后處死。藥熨包制備：乳香、沒藥、紅花、桂枝、千年健、雞血藤、牛大力、飛龍掌血各30 g，打碎置于瓦罐，50 度米酒浸泡，泡制6 個月后取出濾過，濾過后的藥渣密封在陶罐。藥熨包加熱：藥渣裝入純棉藥熨包，將藥熨包置入玻璃器皿，淋米酒，藥熨包濕透但無液體滴出為宜，然后置于微波爐中火加熱5～6 min，擠出多余藥液，干燥棉紗布包裹。藥熨操作：刮除大鼠局部毛發(fā)，取膀胱經(jīng)、督脈、膽經(jīng)[6]，止血鉗持藥熨包以適當力度沿大鼠背部督脈風府穴自上而下燙至身柱穴，然后藥熨督脈兩側膀胱經(jīng)（天柱穴至膈俞穴），最后沿膽經(jīng)風池穴經(jīng)過肩井穴藥熨到肩端，每條經(jīng)脈藥熨20 次，連續(xù)藥熨7 d，動作輕柔連貫，以大鼠皮膚出現(xiàn)潮紅為宜。每次藥熨結束，喂大鼠適量溫水。空白組、模型組不予任何處理，正常飼養(yǎng)，與藥熨組同時處死。

1.5 評價指標及檢測方法

1.5.1 石蠟切片HE 染色實驗 將三組固定的神經(jīng)組織樣本流水沖洗，依次梯度酒精脫水后包埋成蠟塊。切片、烤片后用蘇木精染液、伊紅染液染色，后依次在無水乙醇、二甲苯中脫色透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察、拍照、分析。

1.5.2 透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)細胞溶酶體、自噬小體及超微結構改變 神經(jīng)組織樣本取材投入透射電子顯微鏡固定液固定2～4 h，神經(jīng)組織采用磷酸鹽緩沖液漂洗3 次去上清，1%鋨酸固定后再次磷酸鹽緩沖液漂洗。系列梯度酒精、丙酮脫水后滲透，加入包埋劑包埋固化后超薄切片，鈾鉛雙染色后于透射電子顯微鏡下觀察。

1.5.3 Western blot 檢測蛋白p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達量 取樣品，加入300 μl 的RIPA 裂解液，充分混勻，4℃冰箱裂解2 h。4℃，12 000 r/min 離心10 min（離心半徑5 cm），取上清，檢測蛋白濃度。制備SDS-PAGE 凝膠，樣品變性電泳，將分離的蛋白條帶用半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后對其孵育、檢測。用磷酸鹽緩沖液稀釋一抗；將封閉后的膜直接放入一抗工作液，4℃反應過夜。根據(jù)最后的條帶亮度再次確定一抗的稀釋比例（Beclin-1、LC3A/B、p-Akt、p-mTOR 均為1∶1000），洗膜后，將二抗稀釋3000 倍；將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液，作用90 min 再次洗膜。根據(jù)條帶亮度適當選擇曝光時間。用Image Pro Plus 5.0 圖像分析軟件進行灰度分析，蛋白相對表達量用目標灰度與β-actin 灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組HE 染色結果分析

空白組神經(jīng)根組織形態(tài)基本正常，神經(jīng)根外膜包裹完整，神經(jīng)纖維和胞體排列較整齊，纖維軸突和髓鞘完整，胞體數(shù)量較多。模型組神經(jīng)根組織受損較嚴重，神經(jīng)根外膜包裹不完整，纖維排列紊亂，部分纖維軸突消失；胞體數(shù)量明顯減少，核仁不明顯。藥熨組神經(jīng)根組織形態(tài)部分受損，神經(jīng)根外膜包裹較完整，纖維排列較整齊，胞體數(shù)量較空白組減少但比模型組多，間質(zhì)有輕度炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 三組HE 染色結果

2.2 三組透射電子顯微鏡

空白組細胞胞質(zhì)豐富，線粒體豐富，嵴排列清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體密集，可見少量溶酶體與自噬小體。模型組細胞核有空洞，線粒體膜模糊，部分嵴斷裂，膜破裂。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)見大量溶酶體與自噬小體。藥熨組細胞質(zhì)豐富，線粒體部分膜破裂，部分嵴斷裂溶解。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)的溶酶體與自噬小體數(shù)量均較模型組顯著減少。見圖2。

圖2 三組透射電子顯微鏡下表現(xiàn)

2.3 三組p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比較

模型組p-Akt、p-mTOR 蛋白表達低于空白組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 高于空白組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。藥熨組p-Akt、p-mTOR 蛋白表達高于模型組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 低于模型組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 三組p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比較（n=6）

3 討論

CSR 是由于頸部“陽化氣”功能衰弱[7]，風寒濕邪侵襲致營衛(wèi)失和，濕性黏滯，造成寒凝瘀血痰濕等“陰翳”聚集。組織充血水腫、炎癥細胞浸潤，血液黏稠，阻滯脈絡，經(jīng)氣不通而痛[8]。前期研究顯示，循經(jīng)藥熨可顯著改善CSR 患者神經(jīng)病理性疼痛[4]，下調(diào)血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1L 的水平。自噬在神經(jīng)性疼痛發(fā)展中起重要作用[2]。過度自噬誘導細胞凋亡，自噬程度越高，細胞凋亡越多，兩者呈正相關[9]。PI3K/Akt/mTOR 通路是目前已知調(diào)控細胞自噬的抑制性通路[10]，Akt/mTOR 通路是自噬重要負性調(diào)控路徑[3]。自噬之后繼發(fā)凋亡是Akt/mTOR 通路被抑制的結果，激活Akt/mTOR 通路可抑制細胞凋亡。Akt 是重要的細胞凋亡抑制劑，是PI3K 下游主要靶因子，信號激活后被磷酸化為p-Akt，其表達量可反映磷酸化Akt 整體量[11-12]，是信號通路正向激活標志[13]。mTOR 是Akt 下游重要轉(zhuǎn)導分子，p-Akt 可直接激活其底物mTOR[14]，mTOR 可調(diào)控細胞自噬抑制基因，mTOR 磷酸化為pmTOR 后介導PI3K/Akt/mTOR 通路下游分子降低自噬活性，抑制細胞凋亡，促進細胞周期進程[15-18]。結果顯示，模型組p-Akt、p-mTOR 表達低于空白組，藥熨組p-Akt、p-mTOR 表達高于模型組，提示藥熨組可上調(diào)p-Akt、p-mTOR 蛋白表達量，并激活Akt/mTOR通路，該路徑激活可抑制自噬蛋白活性，降低細胞自噬能力，并在抑制細胞凋亡中起關鍵作用[19-20]。

Akt/mTOR 通路可作用于眾多靶分子調(diào)節(jié)自噬，如自噬關鍵基因Beclin-1、LC3[21]。Beclin-1 及LC3 是自噬標志性蛋白。Beclin-1 可調(diào)控自噬體形成，促進自噬小體起始囊泡形成，與自噬活性密切相關[22]。LC3是公認自噬體特異性標志分子，其蛋白表達量與自噬泡數(shù)量呈正相關[23]。LC3 分Ⅰ型、Ⅱ型，細胞自噬時，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾生成其蛋白水解衍生物LC3-Ⅱ[23]。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可評價自噬水平[24]，本研究模型組自噬因子Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著提升，即應激狀態(tài)下，神經(jīng)根損傷初期自噬較活躍，即細胞凋亡較多。HE 染色顯示造模后細胞有局部炎癥水腫、充血、浸潤改變。透射電子顯微鏡檢查也提示模型組細胞核出現(xiàn)空洞，線粒體的外膜模糊，部分存在嵴斷裂及膜破裂現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見大量溶酶體和自噬小體。藥熨組細胞質(zhì)豐富，溶酶體和自噬小體均較模型組顯著減少。自噬因子Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達均下調(diào)，亦提示細胞自噬活性下降。細胞自噬活性下降，可在一定范圍內(nèi)降低細胞過度凋亡，保護受損神經(jīng)細胞[25]。

藥熨療法通過對體表熱刺激，加以傳統(tǒng)中藥乳香、沒藥、紅花、桂枝、千年健、雞血藤、牛大力、飛龍掌血，具有溫經(jīng)活絡、散瘀鎮(zhèn)痛、祛風除濕等功效[26]。通過加熱使藥物通透表里，深達脈絡以暢通氣血。藥熨鎮(zhèn)痛機制可能與激活Akt/mTOR 通路，適度下調(diào)神經(jīng)細胞的自噬因子Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達，降低細胞凋亡有關。