楊文彬

（漢中市南鄭區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西，723100）

中國是黃瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國，雜種一代黃瓜品種在生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[1]。雜交種子生產(chǎn)成本大、售價(jià)高，因而對種子質(zhì)量要求更高，對生產(chǎn)和貯藏有很大的挑戰(zhàn)。采用傳統(tǒng)方法貯藏黃瓜種子，在高溫潮濕的南方地區(qū)，最多貯存1 a，而在北方地區(qū)一般也只能保存2~3 a[2]。根據(jù)國際植物遺傳資源委員會(huì)（BPGR）推薦的－18℃、（5±1）%含水量進(jìn)行低溫貯藏[3]耗資巨大，這對大部分育種單位、種子經(jīng)營單位來說是很難實(shí)現(xiàn)的。

本試驗(yàn)采用高溫高濕老化法人工加速種子老化，通過測定與分析老化黃瓜種子活力及生理生化指標(biāo)，探尋種子活力下降和種子老化過程中生理生化變化規(guī)律，對合理貯藏黃瓜種子、保持或提高種子活力、確保播種質(zhì)量、滿足生產(chǎn)需要有十分積極的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜種子：農(nóng)城3號(hào)（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院研究育成的一代雜種）。

試劑：三氯乙酸、乙醇、TTC（天津市大茂化學(xué)試劑廠），硫代巴比妥酸、丙酮（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），磷酸（上海展云化工有限公司），磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），牛血清蛋白（北京博爾西科技有限公司），愈創(chuàng)木酚（上海國藥試劑集團(tuán)），30%過氧化氫（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），考馬司亮藍(lán)G-250（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

①種子老化處理 本試驗(yàn)采取高溫高濕老化法（HH）[4，5]處理種子。該方法相對溫和，采取45℃恒溫、相對濕度100%的控制條件較接近于自然環(huán)境，被認(rèn)為是一種較為理想的模擬自然老化的研究方法。

試驗(yàn)于2020年3月開展，共設(shè)4個(gè)處理，即高溫高濕老化處理0、3、5、7 d，以未經(jīng)高溫高濕處理為對照（CK），每處理3次重復(fù)。取3份質(zhì)量相等、大小一致的黃瓜種子置于45℃、空氣相對濕度100%的恒溫培養(yǎng)箱中，分別處理3、5、7 d后取出，于陰涼處攤開晾干后進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

②發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)的測定 將濾紙墊在培養(yǎng)皿底部，加水使其充分吸水至飽和，分別取各小區(qū)種子50粒，均勻放置于培養(yǎng)皿中，加蓋，置于30℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從種子放入培養(yǎng)箱24 h后，連續(xù)7 d每天于固定時(shí)間統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，并計(jì)算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)。發(fā)芽勢（%）＝3 d發(fā)芽種子數(shù)/試供發(fā)芽種子總數(shù)×100；發(fā)芽率（%）＝7 d發(fā)芽種子數(shù)/試供發(fā)芽種子總數(shù)×100；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt/Dt），其中，Gt為每天發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。

③生理生化指標(biāo)的測定 種子浸出液電導(dǎo)率的測定：取各小區(qū)種子50粒稱質(zhì)量（精確到0.01 g）后放置于100 mL燒杯中，注入去離子水50 mL，加蓋，于室溫下浸泡，分別浸泡3、6、12、24 h后測定種子浸出液的電導(dǎo)率。分別采用TTC法、硫代巴比妥酸（TBA）法、考馬司亮藍(lán)G-250染色法、愈創(chuàng)木酚法測定種子的脫氫酶活性（490 nm處測定吸光度A值）、POD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫高濕老化處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)的影響

由表1可看出，隨著老化時(shí)間延長，黃瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著下降（P<0.05，下同）。老化處理3 d后，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均較對照顯著下降，但發(fā)芽率下降不顯著。老化處理5 d后發(fā)芽指標(biāo)均較對照顯著下降。老化處理7 d后黃瓜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別較對照下降50%、65%。說明隨著老化處理時(shí)間延長，黃瓜種子發(fā)芽速度減慢，出苗不整齊，生活力降低。

2.2 高溫高濕老化處理對種子浸出液電導(dǎo)率的影響

由圖1可看出，各處理種子浸出液的電導(dǎo)率均隨浸泡時(shí)間延長而增大，且老化處理時(shí)間越長，種子浸出液電導(dǎo)率越高。經(jīng)老化處理的種子浸出液電導(dǎo)率明顯高于對照。說明老化處理過的種子細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整程度明顯低于未經(jīng)老化處理的種子，且隨著老化時(shí)間的延長，種子細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整程度逐漸降低，這與種子發(fā)芽指標(biāo)的變化情況一致。

圖1 老化不同時(shí)間黃瓜種子浸出液電導(dǎo)率

2.3 高溫高濕老化處理對種子丙二醛（MDA）含量的影響

由表1可看出，經(jīng)老化處理過的黃瓜種子MDA含量均顯著高于對照，且隨老化時(shí)間延長，MDA含量逐漸增加。其中，老化處理3、5、7 d后MDA含量分別比對照增加了0.8%、5.9%、10.5%。

2.4 高溫高濕老化處理對種子過氧化物酶（POD）活性的影響

從表1可看出，隨著黃瓜種子老化處理時(shí)間延長，POD活性顯著下降，其中老化處理3、5、7 d后種子POD活性比對照分別下降20.4%、48.2%、61.3%。

表1 高溫高濕老化處理對黃瓜種子發(fā)芽指標(biāo)、生理生化指標(biāo)的影響

2.5 高溫高濕老化處理對種子可溶性蛋白含量的影響

由表1可看出，老化處理后，黃瓜種子可溶性蛋白含量呈下降趨勢，且隨著老化處理時(shí)間的延長，可溶性蛋白含量下降幅度增加。其中，老化處理5、7 d后可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著低于對照，老化處理3 d后可溶性蛋白質(zhì)含量與對照間差異不顯著。

2.6 高溫高濕老化處理對種子脫氫酶活性的影響

脫氫酶活性密切影響種子的活力，脫氫酶活性愈強(qiáng)，種子活力愈高。由表1可看出，隨老化時(shí)間延長，黃瓜種子脫氫酶活性逐漸下降。其中，老化處理5、7 d后脫氫酶活性均顯著低于對照，老化處理3 d后脫氫酶活性與對照間差異不顯著，說明老化處理的時(shí)間越長，種子脫氫酶活性活性越低。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究表明，隨著高溫高濕老化處理時(shí)間的延長，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均明顯降低，這與棉花[6，7]、玉米[8，9]、油菜[10]種子在人工老化條件下的研究結(jié)果一致。種子在老化過程中，活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞膜質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損[11]，細(xì)胞膜通透性增大，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)迅速滲出，從而導(dǎo)致電導(dǎo)率升高[12]。膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基和MDA。MDA可以結(jié)合抗氧化酶（如POD等），使其活性下降，致使清除自由基能力減弱，又進(jìn)一步加速細(xì)胞膜的受損[13，14]。本研究中，黃瓜種子浸出液電導(dǎo)率及MDA含量均隨老化時(shí)間的延長而升高，POD活性則隨黃瓜種子老化時(shí)間延長而下降，說明老化誘導(dǎo)的膜脂質(zhì)過氧化作用是導(dǎo)致黃瓜種子活力下降的重要原因。

種子貯藏物質(zhì)如可溶性蛋白含量隨老化時(shí)間的延長逐漸下降[15]，這是由于過氧化作用使細(xì)胞內(nèi)的溶酶體受到破壞，提高了貯藏物質(zhì)的降解速度[16]。本試驗(yàn)中黃瓜種子可溶性蛋白含量的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。脫氫酶是種子呼吸過程中的主要酶類，一般認(rèn)為脫氫酶活性隨種子的衰老而降低。崔鴻文等[17]、唐祖君等[18]發(fā)現(xiàn)，黃瓜、大白菜種子老化過程中脫氫酶活性隨著老化天數(shù)的延長而降低。本試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，可見黃瓜種子老化對脫氫酶活性具有一定的影響。

綜上所述，在人工老化過程中，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞膜受損以及抗氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)是黃瓜種子老化、種子活力下降的重要表現(xiàn)。種子浸出液電導(dǎo)率、MDA含量、可溶性蛋白含量、POD活性和脫氫酶活性可作為衡量種子活力的指標(biāo)。