劉 陽 郭 鵬 張 楠 王福金 王靖宇 王愛國

(1.大連醫(yī)科大學實驗動物中心，大連 116044)(2.北京大學人民醫(yī)院胃腸外科，北京 100034)

皮膚傷口愈合始終是醫(yī)學界關注的焦點。傷口愈合包括急性炎癥、細胞增生、組織重建等多個動態(tài)的生理學過程，其中任何一個過程的失調(diào)都可引起傷口惡化，致使傷口愈合延遲，加重患者的痛苦。21世紀以來，冷等離子體醫(yī)學的快速發(fā)展為皮膚傷口的愈合提供了優(yōu)良的治療方案。目前，等離子體因其廣泛的滅菌能力，可減少傷口細菌載量，防止傷口感染；其活性物質(zhì)可促進凝血、激活免疫細胞、調(diào)節(jié)免疫反應、抑制炎癥、促進血管增生、改善組織微循環(huán)、促進細胞增殖和組織修復；同時還具有刺激小、痛苦輕、見效快、使用方便等優(yōu)點，已廣泛應用于臨床的傷口治療。本文在等離子體的基礎簡介后，將從傷口愈合的凝血期、炎癥期、遷移/增殖期以及重塑期的進程，綜述冷等離子體促進傷口愈合的分子機制研究進展。

1 等離子體的概念及分類

1.1 等離子體的概念

等離子體是廣泛存在于宇宙中的除固、液、氣之外的物質(zhì)第四態(tài)，是氣體的電離形式。產(chǎn)生等離子體所需的能量可由熱、化學、電和輻射能單獨提供，也可組合提供[1]。當氣體獲得一定能量后，氣體分子被電離，形成相互作用和自由運動的電子和正離子的混合物，這種物質(zhì)狀態(tài)因其負離子和正離子的總量相等，所以被稱為等離子體。

1.2 等離子體的分類

等離子體根據(jù)粒子溫度，通?？煞譃楦邷氐入x子體(T>108K～109K)與低溫等離子體(<103K)【K：開爾文(熱力學單位)】。高溫等離子體中的氣體幾乎處于完全電離的熱平衡狀態(tài)，各種粒子的平均動能相同，因此也稱為完全熱力學平衡等離子體，一般指核聚變等離子體，包括太陽日冕，磁約束聚變或慣性約束聚變。低溫等離子體按重粒子溫度水平又分為熱等離子體(重離子溫度：3×103K～3×104K)和冷等離子體(重離子溫度：300 K左右)。其中熱等離子體局部處于熱力學平衡，也稱局部熱力學平衡等離子體，由于熱等離子體的高能量密度，目前主要將其用于材料合成、球化、致密以及保護性涂層的沉積。而在冷等離子體中，重粒子溫度相對較低，電子溫度遠大于重粒子溫度，體系處于非平衡狀態(tài)，所以又稱非熱力學平衡等離子體，其主要應用于等離子體刻蝕、沉積以及等離子體表面修飾。生活中被廣泛應用的等離子體均屬于人工等離子體，其常通過燃燒與放電產(chǎn)生，原子彈、氫彈爆炸時及受控熱核聚變所產(chǎn)生的等離子體便是通過燃燒產(chǎn)生，而電弧等離子體，高頻等離子體等則是通過放電產(chǎn)生。工業(yè)應用中一般分為真空(低壓)放電方式和大氣(常壓)放電方式?？紤]到處理速度與成本，冷等離子體的產(chǎn)生通常避開真空放電而選擇大氣壓放電，所以冷等離子體也叫大氣壓冷等離子體(cold atmospheric plasma，CAP)。

由于高溫等離子體與熱等離子體中不僅含有大量的活性物質(zhì)，還伴有大量的熱能，高達幾千至上萬攝氏度，因此限制了其在生物醫(yī)學領域的應用。而冷等離子體(CAP)接近或略高于室溫，不會對生物組織造成熱傷害，為其醫(yī)學臨床應用提供了先決的條件[2-3]。

2 冷等離子體的產(chǎn)生和使用方法

2.1 冷等離子體的產(chǎn)生

為獲得有效的冷等離子體，研究人員研發(fā)了3種電極放電方式，相應地把產(chǎn)生的冷等離子體分為直接、間接與雜合三類[4]。

直接冷等離子體的典型代表是浮動電極——介質(zhì)阻擋放電(floating electrode dielectric barrier discharge, FE-DBD)，高壓(供電)電極通過絕緣介質(zhì)直接與機體(接地電極)相互作用，在其間放電產(chǎn)生冷等離子體(圖1)[5-6]。由于絕緣介質(zhì)的阻擋，可有效抑制兩電極間氣體間隙內(nèi)電流的無限增長，從而避免產(chǎn)生火花放電。依照電流體動力學原理，產(chǎn)生的帶電粒子(等離子體)在電場作用下作定向移動，形成誘導氣流，流向并作用于組織表面。直接冷等離子體可產(chǎn)生均勻和高濃度的等離子體活性物質(zhì)，相較其他放電設備而言，冷等離子體成分也較易控制。其主要缺點是必須保持電極與組織之間的有效距離(1～5 mm)，因此作用區(qū)域范圍小、距離近，應用不便[7]。

圖1 直接等離子體(DBD)原理(A)與實物(B)[7]

間接冷等離子體是先在兩電極之間產(chǎn)生冷等離子體，然后通過氣流形成等離子體射流作用于機體(圖2)[2,6]。間接冷等離子體有效增加了作用距離和安全性，應用廣泛、靈活[3]，且可通過調(diào)節(jié)氣源的種類改變等離子體的活性物質(zhì)組分，從而獲得應用于有特定要求的等離子體[8]。其缺點是需要附加氣源供應設備，作用面積小，不便攜帶[5]。

圖2 間接等離子體(kINPen)原理(A)[9]與實物(B)[7]

雜合冷等離子體的典型代表是表面微放電等離子體(surface micro discharge, SMD)，其依照直接等離子體發(fā)生裝置的原理，將電極設計為三層結(jié)構(gòu)，供電平面電極通過絕緣介質(zhì)平板將高電壓信號施加到網(wǎng)狀電極形成高壓電場，從而在網(wǎng)狀電極一側(cè)產(chǎn)生冷等離子體(圖3)。并借鑒間接等離子體的方法，通過封閉的氣體循環(huán)裝置將產(chǎn)生的等離子體輸送到待處理的組織[9]。雜合冷等離子體大大增加了SMD電極與靶標組織之間的距離，而且不需要附加氣源供應設備[5]。其缺點是需要在封閉的空間內(nèi)實施[9]。

圖3 雜合等離子體(FlatPlaSter)原理(A)與實物(B)[6]

2.2 冷等離子體的應用方法

目前，冷等離子體的應用方法主要分為間接與直接兩種。間接應用是指將冷等離子體作用于培養(yǎng)液，再用處理過的培養(yǎng)液處理細胞，如應用等離子體活化培養(yǎng)液(plasma activated medium, PAM)具有顯著的抗癌作用[10]，關于將CAP間接應用于傷口治療的研究目前還未見相關報道。直接應用是將冷等離子體直接作用于靶組織和細胞，目前已獲得CE認證用于臨床傷口治療的產(chǎn)品化等離子體儀有kINPen?MED(德國)、PlasmaDerm?VU-2010(德國)與SteriPlas(英國)。kINPen?MED已用于治療持久的慢性和感染傷口，特別是在常規(guī)治療失敗的情況下，冷等離子體治療使超過80%的患者重新開始或加速了傷口愈合過程，直至完全閉合傷口[8]；在一項隨機和對照的臨床實驗中，PlasmaDerm在治療慢性腿部潰瘍方面是安全且有效的[11]；此外，有研究經(jīng)證實可有效減少傷口的細菌負擔促進其愈合并減輕局部疼痛[12]。

2.3 冷等離子體的生物活性成分

3 冷等離子體的醫(yī)學應用

目前，等離子體在醫(yī)學領域已經(jīng)展現(xiàn)出廣闊的應用價值。首先，在食物與醫(yī)療器械的滅菌消毒方面，研究發(fā)現(xiàn)等離子體對于革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、細菌孢子、細菌生物膜及真菌等都具有滅活能力，CAP還被證明能有效地滅活空氣和水中的人類諾如病毒和MS2病毒[13]。相比于暴露于高溫或化學品的常規(guī)滅菌方法更溫和更廣譜，具有良好的滅菌消毒作用。另外，因冷等離子體不會對人體和周圍正常細胞產(chǎn)生傷害，安全性高，被廣泛應用于傷口愈合、口腔衛(wèi)生保健領域、美容美膚、血液凝固、腫瘤治療、基因轉(zhuǎn)染等方面[14-19]。特別是在傷口治療方面，相比于其他傳統(tǒng)的治療手段，等離子體不僅顯著的促進了傷口的愈合，而且作用溫和、痛苦少，尚未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用或并發(fā)癥。目前，應用冷等離子體處理創(chuàng)傷已經(jīng)是臨床醫(yī)學領域較為成熟的治療技術手段，具有良好的應用前景，也是研究的熱點。

4 冷等離子體在傷口愈合中的研究進展

大量研究表明，CAP可以有效促進傷口愈合，其分子機制涉及促進再上皮化、釋放細胞因子和生長因子、血管生成、成纖維細胞活化，以及殺菌和抑制炎性反應等[14](圖4)。但目前關于CAP的分子機制研究主要來源于體外實驗，其深入的分子機制仍亟待闡明。傷口的愈合過程大致可分為凝血期、炎癥期、遷移/增殖期、以及重塑期，但傷口實際的愈合過程是連續(xù)且相互重疊的復雜過程，但為了方便敘述，本文將上述的4個經(jīng)典分期為基礎，綜述CAP促進傷口愈合的分子機制研究進展(表1)。

表1 等離子體促進傷口愈合的機制研究進展

注：圖中概括了體內(nèi)外CAP介導的分子與細胞作用：促進再上皮化和加速傷口愈合；通過激活身體保護機制(BD和Nrf2信號傳導)和將免疫細胞募集到傷口區(qū)域來減少炎癥；激活成纖維細胞，誘導肌動蛋白細胞骨架的重新排列并促進基質(zhì)合成(COL1A1，COL14A1)；激活成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞中與傷口愈合相關的細胞因子和生長因子；誘導新生血管的形成。

4.1 凝血期

凝血期是止血和保護傷口的首要階段，其主要過程為形成血栓，封閉傷口，同時為細胞遷移和血小板聚集提供骨架結(jié)構(gòu)[20]。血栓的形成主要是在凝血因子Ⅲ的作用下把凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，凝血酶再通過水解纖維蛋白原使其轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，促進纖維蛋白/血小板凝塊形成，從而達到止血的作用[21]。2006年，有研究通過DBD裝置進行體外凝血實驗，發(fā)現(xiàn)CAP可加快血栓的形成[22]。2017年，有研究通過體外和體內(nèi)實驗進一步證明了CAP的有效促凝血作用[23]。在CAP的促凝血機制研究方面，有研究建立的CAP促使血液中纖維蛋白原凝聚的學說得到了廣泛的認可[24]。但CAP的其他可能促凝血機制尚有待進一步探究。

4.2 炎癥期

炎癥期在受傷后即可啟動，在急性傷口可持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天，在慢性傷口可持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月。此過程主要是炎性細胞遷移至傷口處進行殺菌和清創(chuàng)，為隨后的增殖期創(chuàng)造良好的條件[25-26]。中性粒細胞和巨噬細胞是最主要的炎癥期功能細胞。中性粒細胞的主要功能是清除細菌，預防感染。由單核細胞轉(zhuǎn)化來的巨噬細胞，特別是M1型巨噬細胞發(fā)揮著吞噬壞死組織、崩解的中性粒細胞碎片和細菌產(chǎn)物的重要清創(chuàng)功能。

在殺菌方面，中性粒細胞外網(wǎng)狀陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)結(jié)構(gòu)能限制感染部位的病原體的擴散，并在形成過程中釋放多種殺菌物質(zhì)，創(chuàng)造高濃度的殺菌環(huán)境來捕獲與殺滅病原微生物，是中性粒細胞殺菌的重要機制[27]。CAP可誘導中性粒細胞NETs的產(chǎn)生，增強其殺菌效能[28]。CAP還可誘導中性粒細胞分泌IL-8[28]，而趨化因子IL-8可進一步促使中性粒細胞向傷口部位的遷移。另外，CAP還可以誘導β-防御素的表達[29]。β-防御素是由真核細胞產(chǎn)生的富含二硫鍵的陽離子型抗菌多肽，具有直接殺菌功能。再者，成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞經(jīng)CAP處理后，它們分泌的與創(chuàng)傷愈合相關的細胞因子及生長因子(如IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β、CXCL-1與CD154)表達增高，更有力地招募與激活了炎性細胞，這可能是CAP促進炎癥階段免疫防御的重要因素之一[26]。

在清創(chuàng)方面，有研究發(fā)現(xiàn)CAP可刺激單核細胞分化為巨噬細胞，并進一步促進促炎型(M1型)巨噬細胞的分化，促進清創(chuàng)進程[29]。另外，CAP還可促進M1型巨噬細胞產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-6等促炎細胞因子[30]，進而激活T細胞和漿細胞，促進傷口愈合和抗感染能力[21]。

在炎性反應過程中，創(chuàng)面組織中有白細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤，一旦被激活，它們將產(chǎn)生大量的活性氧，可以起到殺菌，信號傳導，調(diào)節(jié)炎性反應等作用，這是機體自我防御的重要機制。但過度產(chǎn)生的活性氧反而導致了組織損傷和炎性反應加重，致使創(chuàng)面難以愈合[31]。研究發(fā)現(xiàn)，CAP可通過激活機體的抗氧化應激保護機制，拮抗過度的氧化應激，降低炎癥損傷，進而加速傷口愈合[14]。Keap1-Nrf2-ARE是組織細胞抗氧化應激的關鍵信號通路，其最終通過調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達，保護細胞免受炎性反應導致的氧化應激的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)CAP可誘導Keap1與細胞質(zhì)中的肌動蛋白細絲共定位，進而釋放并促進Nrf2的核移位，調(diào)節(jié)抗氧化應激酶的表達，促進傷口愈合[32]。有研究使用CAP處理人THP-1單核細胞，發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶1(Hmox1)表達顯著增加[33]。用CAP處理角質(zhì)形成細胞，Nrf2通路得到了顯著的激活[14]。這些結(jié)果說明，調(diào)節(jié)抗氧化應激是CAP促進傷口愈合的重要分子機制之一。

4.3 遷移/增殖期

此期又稱為肉芽期或增生期，始于皮膚創(chuàng)傷后48 h內(nèi)，持續(xù)2～3周，以不同類型的細胞增殖和遷移為特征。這個階段主要是完成再上皮化與形成肉芽組織，分別由成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和角質(zhì)形成細胞主導完成[20]。

再上皮化包括上皮細胞的增殖、遷移與分化。表皮受損后，損傷處周圍斷端的基底細胞不斷分裂增殖，并向創(chuàng)面遷移，新生的上皮細胞繼續(xù)分裂增生，逐漸分化，最終恢復表皮屏障功能。CAP可以促進角質(zhì)細胞的遷移與增殖繼而促進傷口的愈合。有研究[34]利用CAP處理HaCaT細胞，觀察到HaCaT的運動性顯著增加，還發(fā)現(xiàn)了HaCaT細胞中Cx43 mRNA和蛋白的表達顯著降低，其中Cx43是角質(zhì)形成細胞的縫隙連接蛋白，它的高表達會抑制細胞遷移與傷口愈合的能力。同時，經(jīng)CAP處理后HaCaT增殖率也顯著增加[34]。

真皮和皮下組織的損傷依靠肉芽組織修復。肉芽組織是一種幼稚結(jié)締組織，它的形成主要包括成纖維細胞與內(nèi)皮細胞的增殖，以及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成和新血管的形成，其中膠原纖維是ECM的主要成分[35]。肉芽組織不斷填充創(chuàng)腔，取代了凝血期形成的纖維蛋白臨時基質(zhì)[35]。有研究觀察到利用CAP在短時間內(nèi)處理MRC5成纖維細胞后，成纖維細胞運動性顯著增加[34]。另外，有研究應用CAP處理BALB/c小鼠的皮膚傷口或體外培養(yǎng)的L929鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)CAP可通過誘導ROS的產(chǎn)生，下調(diào)IκBα的表達，進而激活NF-κB信號通路，達到促進成纖維細胞增殖的目的[36]。為了監(jiān)測CAP治療后不同細胞的相互作用，有研究優(yōu)化了一種將角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞結(jié)合在一起的體外共培養(yǎng)模型，通過劃痕實驗，發(fā)現(xiàn)CAP顯著增加了共培養(yǎng)中的相對傷口密度，但對單一相對傷口密度沒有顯著影響[37]。此外，有研究證明了CAP能促進內(nèi)皮細胞的遷移、增殖以及血管生成。他們發(fā)現(xiàn)CAP顯著誘導內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活化與磷酸化，從而增加內(nèi)皮細胞內(nèi)源性NO的水平，進一步激活促血管生成VEGFA/VEGFR2信號通路[38]。在此階段TGF-β也對細胞遷移和增殖、細胞外基質(zhì)合成以及血管生成有積極的作用。有研究表明CAP可以激活成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞中TGF-β1與TGF-β2的表達[29,39]。

遷移/增殖階段的后期，從傷口邊緣遷移/增殖的成纖維細胞在巨噬細胞分泌的TGF-β的作用下，部分細胞分化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞是一種收縮細胞，它通過整合素附著在聚合的纖維連接蛋白和膠原纖維上，并通過富含肌動蛋白的細胞骨架將膠原纖維垂直拉向傷口邊緣，從而使得創(chuàng)面收縮[40]。成纖維細胞與肌成纖維細胞相互作用，產(chǎn)生了ECM。研究表明，CAP不僅可激活成纖維細胞，而且參與成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化[14]。

4.4 重塑期

重塑期又稱為重構(gòu)期，在炎癥期ECM形成后，始于ECM中Ⅲ型膠原被I型膠原取代時，可持續(xù)一年或更長時間[20]。重塑期的核心過程是通過細胞外基質(zhì)的重組、降解和再合成來形成最大的抗拉強度，以I型膠原為主的瘢痕組織，保護傷口[35,40]。在此階段，活化的成纖維細胞(表達α-SMA的肌成纖維細胞)發(fā)揮著核心作用。研究表明，CAP可誘導成纖維細胞活化，增加I型膠原纖維的合成。有研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，CAP處理的成纖維細胞顯著提升了I型膠原纖維的合成和α-SMA mRNA的表達[14,39]。在體內(nèi)實驗中，CAP同樣顯著促進了真皮I型膠原纖維合成，以及COL14A1和α-SMA的表達[14,39]。此外，在Arndt等應用CAP處理成纖維細胞時，還發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(PAI-1)的含量顯著增加[39]。而PAI-1在傷口愈合的重塑期中發(fā)揮著抑制蛋白酶、協(xié)調(diào)組織重塑過程的重要作用。

5 結(jié)語與展望

等離子體醫(yī)學作為一個結(jié)合等離子體物理學、生命科學和臨床醫(yī)學的新興研究領域，越來越多的研究者參與其中，推動了等離子體醫(yī)學的快速發(fā)展。展望未來，等離子體醫(yī)學的研究應著重解決以下三方面問題：(1)等離子體作用分子機制的研究，如：等離子體中起作用的活性物質(zhì)是哪些？等離子的作用是如何從皮膚向深層組織傳導的？等離子體起作用的生物學介質(zhì)是哪些？其生物學介質(zhì)是如何激發(fā)機體的體液和細胞反應的？(2)等離子體發(fā)生裝置的改進，如：廉價、高效等離子體氣源的探索；如何增加等離子體活性物質(zhì)濃度；如何增加等離子體射流的作用面積和作用距離；適用于臨床應用等離子裝置的參數(shù)、標準、最佳工作環(huán)境條件等方面；(3)拓展等離子體在其他疾病治療中的臨床應用，如：腫瘤、炎性反應相關的各種疾病等。