邢 進 馮育芳 高 強 張雪青 趙德明 岳秉飛

(1.中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所(國家嚙齒類實驗動物資源庫)，北京 102629)(2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

海立嚙齒桿菌(Rodentibacterheylii，Rh)和嗜肺嚙齒桿菌(Rodentibacterpneumotropica, Rp)原為嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica，Pp)的Heyl和Jawetz生物型[1-2]，是嚙齒類實驗動物中最常檢出的條件致病菌，在我國SPF級嚙齒類實驗動物中必須排除[3]。Rh和Rp主要經(jīng)由呼吸道侵襲動物，環(huán)境和種群中一旦發(fā)生感染非常難以清除。當環(huán)境或其他病原導致帶菌動物抵抗力下降時，可能引發(fā)全身性感染，對動物實驗及科研數(shù)據(jù)造成較大影響。

根據(jù)北京地區(qū)以往檢測的統(tǒng)計結果，Pp是檢出率最高的呼吸道病原菌，其中Rh的感染率超過90%，遠高于Rp[10-11]。對Rh的控制是防控Pp的關鍵，有效抑制Rh的感染能夠大幅度降低SPF級嚙齒類實驗動物的不符合率。Rh和Rp不僅是實驗動物感染的重要病原，也常作為模式菌用于諸多研究[4]。但由于Rp的致病力更強[5]，此前多以Rp研究Pp，如形態(tài)學[6]、毒力基因[7]、感染模型[8]、免疫學[9]等方面，對Rh的研究相對較少。

外膜蛋白A(OmpA)在大部分革蘭陰性細菌中具有很好的免疫原性，通過免疫斑點實驗和質(zhì)譜測定已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OmpA是Rp最主要的免疫蛋白[12]。有研究[13]曾采用與Rp OmpA同源的流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)P4、P6蛋白免疫小鼠，證實能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生保護作用，減少Pp感染[14]。本研究旨在對Rh的OmpA蛋白進行原核表達和純化，制備重組表達蛋白。通過免疫-攻擊實驗，評價其對小鼠的保護效力。為減少Rh和Rp對實驗嚙齒類動物的污染，為闡明其感染機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：132只SPF級4～5周齡雄性ICR小鼠，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(京)2017-0005】，使用許可證號【SYXK(京)2017-0013】。通過動物福利倫理審查，倫理審批號：中檢動(福)第2019(B)023號。所有受試動物經(jīng)定量PCR(qPCR)和培養(yǎng)法檢測，Rh和Rp陰性。

1.1.2菌株：海立嚙齒桿菌小鼠分離株PP320，本實驗室分離保存；海立嚙齒桿菌ATCC12555和嗜肺嚙齒桿菌ATCC35149(ATCC公司)。BL21(DE3)感受態(tài)細胞(生工生物有限公司)，pET-32α載體由本實驗室保存。

1.1.3小鼠血清樣品：2019年40只小鼠檢品，依據(jù)國家標準[15]檢測為Pp陽性。檢測時采集、分離的血清，由本實驗室保存。

1.1.4主要試劑：哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(Oxiod)；無菌脫纖維羊血(北京路橋)；LB液體和LB瓊脂培養(yǎng)基(Difco)；質(zhì)粒大提試劑盒(Qiagen)；限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI(NEB)；TritonX-100、T4 DNA連接酶、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma)；硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、咪唑、12%Precast-GLgel Tris-Glycine電泳預制膠、非預染蛋白Marker IV、RealBand 蛋白預染 Marker、兔抗6×His多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG和考馬斯亮藍染色液(BBI)；Pfu DNA 聚合酶、IPTG、蛋白濃度測定試劑盒、蛋白質(zhì)加樣緩沖液和W-TMB顯色試劑盒(生工生物)；尿素(北京寶如億)；無菌PBS(Gibco)；瓊脂糖(Invitrogen)；Tris和SDS(Sigma)；Glycine(Diamond)；鄰苯二胺(Solarbio)；HRP標記羊抗小鼠IgG(KPL)；Tween-20(BBL)；其他化學試劑分析純(國藥集團)。

1.2 方法

1.2.1根據(jù)Genbank中Rodentibacter：heyliistrain Ppn222全基因組序列中的OmpA基因序列(NZ_MLAF01000014.1∶7149-8219)設計引物，引物由生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 蛋白表達所用引物

1.2.2PP320OmpA基因的擴增：OmpA擴增反應體系為10× Pfu 緩沖液 5 μL，dNTP(各25 mmol/L)1 μL，Rh-OmpA-F/R各2 μL，Pfu酶(5 U/μL)0.4 μL，PP320 DNA(20 ng/μL)1 μL，補水至50 μL。擴增條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3Rh OmpA蛋白結構分析及密碼子優(yōu)化：以PP320基因組DNA為模板，擴增OmpA基因。經(jīng)測序后，使用Vector NTI Advance 11(Life Technologies Corporation，USA)PP320與Ppn222序列比對，使用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)在線工具搜索PP320 OmpA的開放閱讀框，使用DNAStar Lasergene 7.1軟件(Bioinformatics，USA)中的Protean模塊對兩基因編碼蛋白進行蛋白分析。使用在線密碼優(yōu)化工具(https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis)對OmpA編碼序列進行表達前的密碼子優(yōu)化，消除稀有密碼子，調(diào)整GC含量，增加mRNA穩(wěn)定性，調(diào)整mRNA二級結構穩(wěn)定性，Motif分析。在載體pET-32a-c(+)兩端分別加入酶切位點BamHI和XhoI。

1.2.4目的片斷及載體連接：優(yōu)化后的PP320 OmpA序列由上海生工進行人工合成，以人工合成的優(yōu)化序列作為模板，用引物對Opt-OmpA-F/R擴增目的片斷，擴增條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性24 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，22個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將OmpA目的片斷膠回收純化，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后與載體pET-32a連接后轉入Top10感受態(tài)細胞中，測序檢測篩選出陽性克隆。

1.2.5蛋白誘導表達、純化和檢測：將重組表達質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，IPTG誘導表達，參照參考文獻[16]檢測表達蛋白。使用HisTrap FF標記蛋白純化柱/預裝柱(GE)純化目的蛋白，SDS-PAGE電泳檢測蛋白分子質(zhì)量及Western blot鑒定目的蛋白，最后用蛋白定量試劑盒測定純化后的目的蛋白濃度。

1.2.6動物免疫和抗體消長曲線

1.2.6.1 腹腔肌肉注射：將表達純化OmpA蛋白用無菌PBS分別稀釋至200 μg/mL，分裝1.5 mL離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆?；第一針將表達蛋白與弗氏完全佐劑等量混合乳化，腹腔注射SPF級ICR小鼠，每只0.4 mL，肌肉注射每只0.1 mL，共免疫25只。同時設5只注射PBS對照小鼠，另有20只小鼠作為空白對照，用于后續(xù)感染實驗。第二針于首免后第20天，將弗氏不完全佐劑與表達蛋白等量混合，腹腔注射每只小鼠0.25 mL。于第二針免疫后第10天，取免疫后的小鼠(5只)和PBS對照小鼠(5只)采用安樂死，采血，分離血清。

1.2.6.2 滴鼻法：參照參考文獻[13]的方法，每隔7 d對小鼠進行1次滴鼻免疫，共免疫4次。

取OmpA免疫組和對照組小鼠各5只，定期對采集的免疫前(0 d)和免疫后7、14、21和30 d的免疫血清從1∶20倍開始倍比稀釋，用OmpA表達蛋白作為抗原的ELISA方法測定A492-A405的吸光度值，使用Microsoft Execl2010軟件根據(jù)吸光度值的Log2值繪制抗體滴度消長曲線。

1.2.7半數(shù)致死量：將ATCC12555、ATCC35149和 PP320在血瓊脂上的過夜新鮮培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液分別制成1×104、1×106、1×108和1×1010CFU/mL 4種濃度菌液。根據(jù)菌落總數(shù)測定國家標準[17]，準確計算原始菌液濃度。

72只小鼠隨機分為3組，每組24只，分別腹腔注射上述3種菌液；3種菌液組再各分為上述4個劑量組，注射劑量為每只0.5 mL。根據(jù)小鼠的死亡情況，使用改良寇氏法計算ATCC12555、ATCC35149和PP320的半數(shù)致死量(LD50)及標準誤。根據(jù)LD50所需菌量，制備相應濃度的3種菌液，分別腹腔注射免疫小鼠和同日齡未免疫小鼠，每2 h觀察動物狀態(tài)至24 h。

1.2.8免疫效果實驗：用分離株PP320的1×106CFU/mL濃度菌液，對OmpA免疫小鼠和未免疫對照小鼠各5只，用移液器吸取20 μL菌液滴鼻。飼養(yǎng)30 d后，采集咽拭子[18]，用qPCR方法檢測Rh拷貝數(shù)，擴增條件為50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃15 s,58 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，引物和探針序列見表2。

表2 Rh 和Rp 的qPCR 引物和探針

1.2.9陽性血清樣品中OmpA抗體的ELISA檢測：參考實驗動物酶聯(lián)免疫吸附實驗國家標準[19]，將原核表達純化后的OmpA蛋白用包被液稀釋，濃度為1、3和5 μg/mL，分別包被聚苯乙烯酶標板，使用ELISA檢測免疫小鼠血清，確定最佳包被濃度。選擇最佳包被濃度，用建立的OmpA ELISA方法對40份Pp(Rh或Rp)陽性小鼠血清進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19.0(IBM)對各實驗組與對照組間的血清免疫抗體效價和抗體保護實驗進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較采用Student’st-檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 海立嚙齒桿菌OmpA蛋白結構分析

在PP320的OmpA基因序列中，最大的開放閱讀框位于1～1 071 bp，編碼356個氨基酸，以此段蛋白作為目的蛋白，分子質(zhì)量為37 553.36，等電點為9.01。OmpA二級結構和抗原表位分析見圖1。

圖1 PP320 OmpA蛋白二級結構和抗原表位分析

經(jīng)Gamier-Robson和Chou-Fasman兩種方法預測二級結構，此段氨基酸序列中α螺旋約占62.1%，β折疊占比約52.5%，β轉角占比約27.8%，無規(guī)則卷曲約占9.6%。經(jīng)Kyte-Doolittle和Hopp-Woods方法預測，OmpA的親水性區(qū)域約占比66.0%，主要分布在20～29、36～64、88～130、136～160、180～256、248～256、278～299、314～338、343～356等大部分氨基酸殘基。經(jīng)Emini方法預測，表面可能性區(qū)域占比29.2%，主要集中在21～26、90～107、192～204和278～296等多個區(qū)域。Karplus-Schulz方法預測，柔韌性區(qū)域主要位于41～50、89～107、137～152等23個區(qū)域，占氨基酸序列的43.5%。經(jīng)Jameson-Wolf方法及預測的OmpA蛋白的結構特性，綜合得到潛在的B細胞優(yōu)勢抗原表位主要位于39～64、87～109、278～300等9個區(qū)域，共236個氨基酸，約占整個氨基酸序列的63.3%。綜合AMPHI和Rothbard-Taylor兩種方法預測，T細胞優(yōu)勢抗原表位占比較少，主要位于35～52、67～72等18個區(qū)域，共132個氨基酸，約占整個氨基酸序列的37.1%。

2.2 重組質(zhì)粒的構建

表達載體pET-32a經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后，獲得線性化載體。與OmpA目的片段經(jīng)T4連接，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，見圖2。用引物對T7/T7t擴增，經(jīng)測序驗證結果準確。

注：1.Marker SM0331；2.pET32a-OmpA重組質(zhì)粒酶切片斷

2.3 Western blot檢測SDS-PAGE蛋白表達

SDS-PAGE電泳結果顯示在相對分子質(zhì)量53 000左右出現(xiàn)明顯的目的條帶，符合理論值，見圖3。經(jīng)鎳離子親和層析純化，對SDS-PAGE凝膠進行轉膜，TMB顯色試劑盒顯色，用Western blot方法對純化蛋白進一步驗證，見圖4。確認所獲得的蛋白為OmpA。

注：1.Protein Marker IV；2.誘導前總蛋白；3.20 ℃上清；4.20 ℃沉淀；5.37 ℃上清；6.37 ℃沉淀

注：1.Protein Marker；2.OmpA純化融合蛋白

2.4 蛋白濃度測定結果

經(jīng)蛋白定量試劑盒測定，待測體積20 μL時，表達蛋白在480 nm下的吸光度平均值為0.891 5。根據(jù)標準BSA測定值繪制出標準曲線方程為Y=-138.63X+127.03，可求得OmpA表達蛋白濃度為0.34 mg/mL，共收獲17 mL。

2.5 蛋白免疫效價測定

取OmpA免疫組和對照組各5只小鼠，對免疫前(0 d)和免疫后7、14、21和30 d的血清做倍比稀釋后，測定A492-A405的吸光度值，根據(jù)吸光度值的Log2繪制抗體滴度消長曲線，見圖5。采用腹腔加肌肉免疫途徑時，平均抗體滴度為19.84log2。

圖5 抗體滴度消長曲線

2.6 嗜肺巴斯德桿菌陽性小鼠血清OmpA抗體檢測

40份Pp(Rh或Rp)陽性小鼠血清經(jīng)OmpA為抗原包被的ELISA方法檢測，樣品陽性判定標準為吸光度值0.317±0.104，陰性樣品A值為0.069±0.078，陽性率為24/40(60%)。

2.7 LD50測定

用3種菌株的4個濃度菌液1×104、1×106、1×108和1×1010CFU/mL分別攻擊小鼠，根據(jù)公式計算得出ATCC12555和PP320的LD50均為4.6×107CFU/mL，lgLD50的標準誤為0.27；ATCC35149的LD50約為1×107CFU/mL，標準誤為0。

2.8 免疫保護效果

2.8.1腹腔攻毒：根據(jù)LD50結果，配制1×109CFU/mL的 ATCC12555、ATCC35149和PP320三種菌液，分別對OmpA免疫和未免疫小鼠腹腔接種攻毒，致死率結果見表3。OmpA和對照組均差異顯著(P<0.001)。攻毒后，未免疫小鼠表現(xiàn)為精神沉郁，被毛直立，卷臥。在4 h時開始出現(xiàn)死亡，瀕死小鼠眼部紅腫，呼吸急促，拉稀，肛門處沾有糞便，嚴重者表現(xiàn)為典型的侵肺癥狀，口鼻出血死亡。

表3 免疫保護實驗結果

2.8.2qPCR檢測滴鼻感染：感染30 d后，取所有15只小鼠的咽拭子，用前述方法提取基因組DNA，并用qPCR方法檢測，CT值結果見圖6。未免疫組小鼠的Rh核酸拷貝數(shù)為1 128.82±625.08，OmpA免疫組小鼠中Rh核酸拷貝數(shù)為41.99±35.38，OmpA免疫組與未免疫組均差異顯著(P<0.01)。

圖6 滴鼻感染小鼠咽拭子qPCR檢測結果

3 討論

Rh的OmpA蛋白推導氨基酸序列具有良好的親水性和B細胞抗原表位。對密碼子優(yōu)化后再通過大腸桿菌原核表達，首次獲得了Rh的OmpA重組表達蛋白。采用肌肉/腹腔聯(lián)合注射的途徑免疫ICR小鼠，可獲得高滴度OmpA特異性抗體。使用Rh ATCC12555、Rp ATCC35149和Rh分離株PP320三種菌液攻毒分別對免疫小鼠腹腔攻毒，小鼠的死亡率顯著降低(P<0.001)，免疫小鼠對Rh的保護力明顯高于Rp。結果表明，Rh與Rp的OmpA存在差異，Rh的OmpA不能有效抵抗Rp的感染。

Fingas等表達了位于外膜蛋白中的CARLO-1蛋白，對30只確定感染Rp的小鼠血清檢測結果為53%，與Rh陽性血清無交叉反應[12]。本研究利用OmpA表達蛋白作為包被抗原，用ELISA對已知Pp陽性小鼠血清檢測，陽性率為60%，略高于Fingas所獲結果。不同的是，本研究中所用陽性血清并不確定是Rh或Rp感染。已知不同品系的小鼠感染Rp后，所產(chǎn)生的免疫應答也隨之不同[12]，因此Rh的OmpA為抗原的ELISA方法是否能夠覆蓋Rp抗體尚有待進一步驗證。實驗動物血清是微生物檢測中主要采集的動物樣品之一，利用動物血清對Rh或Rp開展監(jiān)測是非常可行的補充方式。檢測過程中一旦發(fā)現(xiàn)存在可疑樣品，可以追溯到相應動物，再采用分子生物學方法進行驗證確診，減少對動物的反復操作造成的影響。

OmpA是OMPs家族在呼吸系統(tǒng)中起黏附素和侵襲素的作用。呼吸道上皮通過檢測病原體和激活引起抗菌和促炎分子釋放的信號傳導途徑，在肺部防御中起關鍵作用。細菌對呼吸道上皮的黏附是引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病和激活宿主抗性機制的第一步。OmpA可以幫助細菌逃避宿主的防御，具有高度的免疫原性，可作為先天免疫系統(tǒng)的靶點，達到增強殺菌效果和清除細菌的目的[20]。有研究[9]證明，經(jīng)PnxIII重組毒素鼻內(nèi)免疫的小鼠鼻腔，在氣管、結膜和盲腸未發(fā)現(xiàn)Rp定殖。表明在無佐劑的情況下，黏附蛋白經(jīng)鼻內(nèi)免疫可預防Rp感染。此外，小鼠鼻內(nèi)接種免疫Rh和Rp的兩種外膜蛋白后，能夠減緩或減輕Rh或Rp感染引起的肺炎癥狀[13]。相反，本研究中OmpA的滴鼻免疫效果不佳，抗體滴度無法達到腹腔/肌注的效果?？赡苁窃诘伪沁^程中，部分抗原被小鼠舔舐，未能足量吸收所致。

在實驗動物的飼養(yǎng)管理中，Rh和Rp是非常重要的微生物控制指標，直接關系到種群健康和動物實驗。隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，模式動物和實驗動物新品種不斷涌現(xiàn)，有效的凈化措施和防控手段是確?？蒲泄ぷ黜樌_展的關鍵。本研究根據(jù)病原菌的實際流行情況，制備了Rh的OmpA重組蛋白，該蛋白可以作為疫苗對珍貴的動物品種進行免疫，避免相關疾病的突然暴發(fā)。并且該蛋白能夠用于Rh感染的血清學檢測，為此類病原的日常監(jiān)測提供新的手段。