鄭心茹 張曉清 楊 洋 王吉魁 韓 雪

(1.中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，沈陽 110122)(2.遼寧電力中心醫(yī)院普外科，沈陽 110057)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見的瘙癢性炎癥性皮膚病，其主要臨床表現(xiàn)為皮膚紅斑、斑塊。在過去的幾十年中，特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率逐年增加，它已成為全球性的健康問題。AD發(fā)病原因復(fù)雜，涉及皮膚局部及全身的免疫系統(tǒng)失衡、皮膚屏障功能障礙、環(huán)境因素以及神經(jīng)心理因素等。因此目前特應(yīng)性皮炎的治療仍具有一定的難度和挑戰(zhàn)性。

小鼠特應(yīng)性皮炎模型已經(jīng)成為研究此疾病發(fā)病機(jī)制、評價(jià)研發(fā)藥物安全性與有效性等生物醫(yī)藥研究不可取代的模式動物。一個成功的動物模型應(yīng)該具有盡可能多的與人體疾病相似的特點(diǎn)，迄今為止，小鼠的AD模型建立主要有以下幾種方法，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一類能夠自然發(fā)展為AD樣皮損的近交系小鼠模型，如Nc/Nga小鼠及Flaky Tail小鼠等，這類模型主要與保障皮膚完整性的相關(guān)基因缺失或者突變相關(guān)；過表達(dá)或缺失目的基因的基因工程小鼠模型，這類模型僅是在單一通路上活化或抑制，在疾病表現(xiàn)上與人類AD臨床表現(xiàn)仍有一定的出入，并且仍需要特定抗原誘導(dǎo)，這使其在AD研究中的使用受到限制；最常見的一類小鼠模型是通過皮膚局部致敏物質(zhì)誘導(dǎo)的AD模型，如DNCB、DNFB、TNCB及OXA等，這類半抗原更易穿透皮膚，相比較之下利用致敏物質(zhì)誘導(dǎo)的方法顯得更為經(jīng)濟(jì)及方便。

近些年來有文獻(xiàn)報(bào)道，以半抗原2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB)致敏激發(fā)小鼠可成功建立特應(yīng)性皮炎模型。本研究利用DNCB作為致敏原，探討不同的給藥濃度以及給藥時間之間的差異，以尋求DNCB誘導(dǎo)AD模型的最適條件，為研究AD的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供依據(jù)和幫助。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性SPF級BALB/c小鼠(8～10周),由遼寧長生實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(遼)2020-0001】，使用許可證號【SYXK(遼)2018-0008】。飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，環(huán)境溫度為22 ℃～25 ℃，濕度為50%～65%，利用12 h∶12 h晝夜間斷照明，小鼠食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，隨意飲水進(jìn)食。小鼠進(jìn)行一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

2，4-二硝基氯苯(DNCB)(Sigma公司)；細(xì)胞因子ELISA試劑盒(R&D公司)；IgE ELISA試劑盒(Invitrogen公司)；基質(zhì)溶液為丙酮和橄欖油4∶1的比例配制而成；酶標(biāo)儀iMark、RT PCR儀CFX96 TOUCH(伯樂公司)。

1.3 方法

1.3.1動物分組及模型建立：造模前一天對所有小鼠背部皮膚進(jìn)行剃毛處理，范圍約2 cm×4 cm。將實(shí)驗(yàn)組小鼠分為A～D 4組，每組6只。初期涂抹200 μL DNCB溶液致敏(基質(zhì)液丙酮∶橄欖油=4∶1)，間隔幾天后200 μL DNCB溶液激發(fā)，對照組小鼠涂抹相同劑量的基質(zhì)溶液。末次激發(fā)給藥后24 h處死小鼠取材。完整摘取小鼠脾及體質(zhì)量，用電子天平稱脾重量，并計(jì)算小鼠脾指數(shù)【脾指數(shù)=脾重量(mg)/體質(zhì)量(g)】。各組給藥濃度及涂抹的時間見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組致敏階段、激發(fā)階段給藥濃度及給藥時間

1.3.2皮膚組織炎癥評分：小鼠末次給藥后，肉眼觀察每只小鼠皮膚炎癥程度，根據(jù)以下幾種癥狀進(jìn)行判定：水腫、紅斑/出血、潰爛/表皮脫落、結(jié)痂/干燥。每種癥狀按照0分(無)、1分(輕度)、2分(中度)和3分(嚴(yán)重)進(jìn)行評分，最終評分按照幾種癥狀評分相加之和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3皮膚組織病理學(xué)檢查：取小鼠的背部皮膚組織，加入4%多聚甲醛固定，進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，制作4 μm厚切片，分別進(jìn)行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色。顯微鏡下觀察皮損處皮膚組織病理結(jié)構(gòu)及上皮層厚度、細(xì)胞水腫、炎細(xì)胞以及肥大細(xì)胞浸潤水平。

1.3.4ELISA法檢測小鼠血清IgE水平：小鼠眼球取血，4 ℃放置2 h，10 000 r/min離心10 min。吸取上層血清放入-80 ℃冷凍備用。參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測小鼠血清中IgE分泌水平。

1.3.5皮膚勻漿液細(xì)胞因子表達(dá)水平的檢測：取小鼠背部皮膚100 mg，加入1 mL PBS勻漿，1 500 r/min離心5 min。吸取勻漿上清液放入-80 ℃冷凍備用。參照ELISA試劑盒說明書檢測皮膚勻漿液中IL4、IL5及IL13分泌水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚表現(xiàn)

激發(fā)濃度最后一次給藥24 h后，選用最具代表性的病變進(jìn)行評分。空白對照組小鼠背部皮膚外觀正常。與空白對照組相比A組可以發(fā)現(xiàn)小鼠背部皮膚水腫、有明顯紅斑、伴有少量潰爛。B組小鼠背部皮膚水腫，伴有部分表皮脫落。C組小鼠背部皮膚輕度水腫。D組小鼠背部皮膚明顯出現(xiàn)水腫、紅斑、粗糙、潰爛及結(jié)痂表現(xiàn)(圖1)。與空白對照組相比，A、B及D組皮炎評分顯著升高(P<0.01，P<0.001)，與A、B及C組相比，D組小鼠皮膚改變嚴(yán)重程度明顯升高(P<0.001)，C組與空白對照組相比P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

圖1 對照組和各模型組小鼠背部皮膚

注：與空白對照組相比，#P<0.01,##P<0.001；各模型組之間相互比較，*P<0.01, **P<0.001

2.2 各組小鼠脾指數(shù)比較

處死小鼠后測量小鼠脾及體質(zhì)量，根據(jù)脾指數(shù)計(jì)算得出以下結(jié)果(圖3)，在模型A組及D組小鼠中可見脾明顯增大，脾指數(shù)明顯升高(P<0.05，P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組及C組脾指數(shù)無明顯增加(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型A組相比，模型D組脾指數(shù)升高明顯(P<0.05)。

注：與空白對照組相比，#P<0.05, ##P<0.01；各模型組之間相互比較，*P<0.05

2.3 各組小鼠皮膚病理學(xué)改變

組織病理結(jié)果(圖4)顯示：HE染色可見空白對照組背部皮膚結(jié)構(gòu)完整，無細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤，模型A組小鼠皮膚棘層增厚，細(xì)胞內(nèi)水腫，炎性細(xì)胞浸潤。B組小鼠皮膚棘層增厚，少量細(xì)胞水腫。C組小鼠皮層未見明顯增厚，僅可見少量細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤。D組小鼠皮膚棘層明顯增厚，細(xì)胞內(nèi)水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，皮膚結(jié)構(gòu)不完整。甲苯胺藍(lán)(toluidine blue staining，TB染色)顯示肥大細(xì)胞浸潤水平，空白對照組背部皮膚未見明顯肥大細(xì)胞浸潤，模型組中均出現(xiàn)不同程度的肥大細(xì)胞浸潤，模型A及D組尤為明顯。

注：與空白對照組相比，#P<0.05, ##P<0.001；各模型組之間相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 各組小鼠血清IgE水平比較

通過ELISA檢測了小鼠外周血中總IgE的水平?？瞻讓φ战M小鼠血清IgE為(68.09±26.59)ng/mL，模型A組小鼠血清總IgE為(242.00±67.77)ng/mL，模型B小鼠血清總IgE為(227.26±26.13)ng/mL，模型C小鼠血清總IgE為(216.56±54.75)ng/mL，模型D小鼠血清總IgE為(337.53±70.19)ng/mL。4組模型組小鼠IgE水平均明顯高于空白對照組(P<0.05，P<0.01)，模型D組與模型B組及C組相比IgE明顯升高(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

注：與空白對照組相比，#P<0.05, ##P<0.01；各模型組之間相互比較，*P<0.05, **P<0.01

2.5 各組小鼠皮膚勻漿液細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

由于AD是一個Th2型為主的免疫反應(yīng)，在DNCB誘導(dǎo)的小鼠模型中，Th2型細(xì)胞因子也會出現(xiàn)明顯升高，通過ELISA檢測小鼠背部皮膚組織勻漿液中IL-4、IL-5、IL-13的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-4在模型A、B、D組中濃度明顯高于空白對照組，IL-5、IL-13在4組模型組中濃度均明顯高于空白對照組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。對各模型組間的細(xì)胞因子也進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(圖6)。

注：與空白對照組相比，#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001；各模型組之間相互比較，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

3 討論

近年來，我國對于化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)形成特異性皮炎動物模型的已有較多研究報(bào)道。在動物模型的建立過程中，不同的動物品系、年齡、體質(zhì)量和不同處理方式對建模成功與否以及指標(biāo)檢測結(jié)果均有不同程度的影響[1]。為研究特異性皮炎的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的治療方法，迫切需要建立成功的AD動物模型，這對得出正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)論與服務(wù)更好的臨床治療具有重要意義。

特異性皮炎是一種以瘙癢為特征的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病因素與遺傳、皮膚屏障功能障礙、免疫失調(diào)、皮膚微生態(tài)改變息息相關(guān)[2]。其臨床表現(xiàn)主要為皮膚出現(xiàn)明顯干燥，繼而出現(xiàn)紅斑、丘疹和水皰為表現(xiàn)，幾周后由于瘙癢引起搔抓反應(yīng)進(jìn)而皮膚出現(xiàn)糜爛或出現(xiàn)黃色痂皮，炎性反應(yīng)色素減退現(xiàn)象。在外源性AD的急性期，由于外周血Th2水平增高[3]，細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平增高，促使B細(xì)胞產(chǎn)生過量IgE，嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量也增多，激活Toll樣受體，激發(fā)機(jī)體先天性免疫[4]。

在建立AD模型過程中，通常可使用卡泊三醇[5]、粉塵螨[6]和半抗原等物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)中采用DNCB試劑，DNCB具有半抗原屬性，當(dāng)其進(jìn)入動物體內(nèi)后，可與上皮蛋白的可溶部分進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，使其結(jié)合為完全抗原。完全抗原使機(jī)體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞。當(dāng)DNCB再次進(jìn)入體內(nèi)時，致敏的淋巴細(xì)胞與其接觸便會產(chǎn)生過敏反應(yīng)[7]。此過程在用于檢測細(xì)胞免疫功能的同時，也可以用來建立AD模型[8]。根據(jù)DNCB作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的DNCB致敏及激發(fā)BALB/c小鼠背部，給藥天數(shù)也不同，根據(jù)小鼠致敏處皮膚炎癥程度及相關(guān)指標(biāo)的檢測來判定小鼠特異性皮炎模型建立的最佳方法。

在末次激發(fā)濃度給藥24 h后，觀察可見致敏處皮膚出現(xiàn)不同程度的水腫、紅斑或出血、潰爛或表皮脫落、結(jié)痂或干燥。對比可見模型D組造模效果最好，其余A、B、C 3組效果依次較差。病理學(xué)檢測結(jié)果也與典型的特應(yīng)性皮炎改變最為接近，相比與其他組改變也最為顯著。研究證實(shí)大多數(shù)AD患者血清IgE濃度高于健康人群，IgE濃度升高程度與AD皮損嚴(yán)重程度和廣度基本平行[9]。因此，血清IgE濃度常被作為AD動物模型評價(jià)的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法可測定小鼠血清IgE，通過對比可見，4組模型IgE濃度較空白對照組均有升高，模型D組的血清IgE濃度升高也最為明顯。由于細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13濃度也可呈現(xiàn)AD嚴(yán)重程度，本實(shí)驗(yàn)也測定了這3項(xiàng)濃度，對比可見模型D組小鼠細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)水平最高[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)通過給予4組模型不同濃度及給藥時間，證實(shí)了初期涂抹0.5%DNCB溶液200 μL 3次，后期每次6 d間歇涂抹1%DNCB溶液200 μL，可實(shí)現(xiàn)較好的造模效果，與實(shí)際AD的疾病特點(diǎn)更為貼近。建立更加合適的動物模型可以幫助臨床更充分的認(rèn)識AD對機(jī)體帶來的損害，更有利于分析及預(yù)測可出現(xiàn)的病理生理反應(yīng)，對全面認(rèn)識疾病的本質(zhì)及對疾病的治療有重要意義。