劉嘉儀 周 妍 石紅杰 胡宇峰,3 李紅良

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060)(2.武漢大學(xué)模式動(dòng)物研究所，武漢 430071)(3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071)

病理性心肌肥厚通常由壓力刺激或由疾病引起，例如高血壓、瓣膜性心臟病、心肌梗死和神經(jīng)激素[1]。在疾病早期，心臟通過一系列反應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激作出反應(yīng)，包括腔室容積，收縮期收縮，舒張期舒張?jiān)黾有呐K超負(fù)荷發(fā)揮補(bǔ)償作用。然而，持續(xù)的病理性心肌肥厚最終導(dǎo)致收縮功能障礙和心力衰竭[2]。改善心肌肥厚可以降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，然而由于對(duì)病理性心肌肥厚發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限，臨床治療方法尚未得到優(yōu)化，因此迫切需要探索新的靶點(diǎn)來治療病理性心肌肥厚。

Fas凋亡抑制分子2(Faim2)是一種膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為35 000。作為跨膜Bax抑制基序(TMBIM)家族的成員[3]，F(xiàn)aim2是一組進(jìn)化上高度保守的跨膜蛋白，具有細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡特性[4]。在其具體作用上，F(xiàn)aim2通過與LC3相互作用介導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)[3]。另外有實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)aim2在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠短暫性血管缺血模型中均具有保護(hù)作用[5-6]，此外,Faim2可能與2型糖尿病患者發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[7]。并且本實(shí)驗(yàn)室前期的一項(xiàng)研究報(bào)告了Faim2同家族成員，溶酶體膜蛋白1通過靶向TLR4降解改善病理性心肌肥厚[8]?？梢姡現(xiàn)aim2與心血管疾病有一定潛在聯(lián)系。但目前還沒有結(jié)果證實(shí)Faim2在心肌肥厚中的作用。而在心肌肥厚的過程中，自噬、氧自由基的形成、細(xì)胞凋亡等均為引起細(xì)胞損傷的主要機(jī)制[9]?；贔aim2在血管缺血模型和自噬中的調(diào)控，我們合理猜測(cè)其在心肌肥厚中可能發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建Faim2基因敲除小鼠，并使用主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction,TAC)手術(shù)建立小鼠心肌肥厚模型，深入研究Faim2在心肌肥厚中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)選取雄性SPF級(jí)C57BL/6J背景的Faim2基因敲除小鼠及其同窩對(duì)照小鼠，年齡8～10 周，體質(zhì)量23～28 g，小鼠基因鑒定結(jié)果見圖1。所有入組動(dòng)物均飼養(yǎng)于武漢大學(xué)模式動(dòng)物研究所的SPF級(jí)環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證【SCXK(鄂)2019-0004】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證【SYXK(鄂)2019-0013】。確保恒溫、恒濕，12 h∶12 h晝夜間斷照明，提供飼料與飲用水，保證動(dòng)物自由進(jìn)食。本文中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)審查，倫理審批號(hào)：WDRM動(dòng)(福)第20201206D號(hào)，并按照國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與利用指南嚴(yán)格執(zhí)行。

1.1.2試劑與儀器

1.1.2.1試劑：戊巴比妥鈉(80～90 mg/kg，Sigma-Aldrich，P3761)，細(xì)胞核染料(0100-20，Southern Biotech)RIPA(65 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1% NP-40, 0.5%脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS, 1×蛋白酶抑制劑和1×磷酸酶抑制劑)，伊紅染液(BASO公司，BA-4024)，蘇木精染液(谷歌生物公司，G1004)，天狼猩紅染液(海德創(chuàng)業(yè)生物科技公司，26357-02)，抗體：Faim2(Abcam公司,Ab72113)。

1.1.2.2儀器：使用小型動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(VEVO2100，F(xiàn)ujifilm Visualsonics)，Chemi Doc MP 成像系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules)，電泳儀(伯樂公司，Power Pace Basic)，研磨儀，超聲破碎儀，低溫離心機(jī)(Thermo公司，LEGNED MICRO17)。

1.2 方法

1.2.1Faim2-KO小鼠構(gòu)建：采用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Faim2基因全敲小鼠。通過在線CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)預(yù)測(cè)Faim2的引物序列為5’-GCCCTCGGCGCCACCCTCCTAT GAGG-3’，設(shè)計(jì)1條sgRNA：5’-GCCCTCGGCGCCA CCCTCCTATGAGG-3’，將對(duì)應(yīng)sgRNA的ssODNs通過退火形成雙鏈DNA，將雙鏈DNA連入經(jīng)BsaI限制性內(nèi)切酶酶切的pUC57-sgRNA(Addgene 51132)構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體。以上述構(gòu)建的sgRNA表達(dá)載體為模板，使用如下引物通過PCR擴(kuò)增含有T7啟動(dòng)子及引導(dǎo)序列的DNA片斷：正向引物：GATCCCTAATACGACTCACTATAG；反向引物：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。以所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板使用T7 Transcription Kit(Invitrogen, AM1354)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；Cas9質(zhì)粒(Addgene 44758)通過T7 ULTRA Transcription Kit(Invitrogen, AM1345)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用Transcription Clean-Up Kit(Invitrogen, AM1908)純化后，通過FemtoJet 5247顯微注射系統(tǒng)注射入C57BL/6小鼠的單細(xì)胞受精卵內(nèi)，并將其移植到代孕雌鼠輸卵管中，經(jīng)過19 d妊娠之后得到F0代小鼠。小鼠出生2周后，取耳部或尾部組織，提取基因組DNA進(jìn)行鑒定?；蚓庉嬓∈蠡蜩b定引物：Faim2-F：5’-CTCGCACAGGTTGG AAGAGT-3’，F(xiàn)aim2-R：5’-GAGACTTACTGGGGTC CACG-3’,野生型小鼠包含一段長(zhǎng)325 bp的DNA序列，而突變小鼠(Faim2基因敲除小鼠)該DNA序列發(fā)生切割，切除19 bp序列，從而導(dǎo)致目的基因編碼過程發(fā)生移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。實(shí)驗(yàn)所用小鼠為突變體純合子。

1.2.2病理性心肌肥厚模型建立：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，夾趾無明顯反應(yīng)為麻醉成功；繼而將小鼠插管并連接到呼吸機(jī)觀察小鼠胸廓波動(dòng)。使小鼠右側(cè)臥位，對(duì)手術(shù)區(qū)皮膚進(jìn)行充分消毒，左胸皮膚鈍性分離軟組織和肌層，用眼科鉗在第二、三肋骨水平打開胸腔，充分暴露手術(shù)視野[10]。鈍性分離主動(dòng)脈弓降支與左肺并使用7-0縫線穿過。在血管上方平行放26 或27 g的針將血管打結(jié)后拔出。術(shù)后關(guān)閉胸腔，多普勒超聲心動(dòng)圖證明手術(shù)成功。假手術(shù)組進(jìn)行相同操作，但沒有進(jìn)行主動(dòng)脈結(jié)扎。小鼠自主呼吸后拔除氣管插管，將小鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，放置飼料和飲用水，密切觀察狀態(tài)。

1.2.3心臟組織病理學(xué)檢測(cè)：用10%甲醛固定心臟，脫水，石蠟包埋。石蠟切片厚度一般為5 μm，使用蘇木精-伊紅染色和天狼星紅染色觀察心臟切片的組織病理學(xué)和膠原沉積，并用細(xì)胞核染料標(biāo)記細(xì)胞核。用圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)測(cè)量心肌細(xì)胞橫截面積和左心室膠原面積[11]。

1.2.4Western blot 鑒定基因小鼠構(gòu)建結(jié)果：小鼠左心室組織加入含蛋白酶抑制劑的Radio Immunoprecipitation Assay 緩沖液和鋼珠，放入?yún)?shù)為30 Hz的研磨儀中充分研磨90 s，取出鋼珠后，樣品使用5K Hz的超聲破碎儀裂解120 s，待裂解充分，置于4℃，12 000 r/min 離心 30 min。離心后取上清并用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。蛋白變性后于10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，設(shè)置參數(shù)80 m V恒壓；2 h。電泳完成后，以300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并使用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，隨后在4℃冰箱中一抗孵育過夜。使用 Chemi Doc MP 成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Faim2-KO小鼠構(gòu)建

為研究Faim2在病理性心肌肥厚中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Faim2基因敲除(Faim2-KO)小鼠(圖1A)，并通過Western blot驗(yàn)證了基因敲除效率(圖1B)，結(jié)果顯示，F(xiàn)aim2基因敲除小鼠構(gòu)建成功。

注：A.C57/6J小鼠Faim2基因示意圖(E2,199 bp)。翻譯起始位點(diǎn)(ATG)位于E1，單引導(dǎo)RNA(SgRNA)靶位點(diǎn)以紅色突出顯示;B.WT小鼠與KO小鼠心臟組織中Faim2的蛋白表達(dá)水平

2.2 Faim2敲除對(duì)小鼠病理性心肌肥厚的影響

與WT小鼠相比，F(xiàn)aim2-KO小鼠在TAC 4周后心臟大小明顯增大，且室壁增厚，心肌細(xì)胞橫截面積顯著增加。以上結(jié)果提示Faim2-KO心肌肥厚程度明顯加重(圖2)。

注：A.TAC術(shù)后4周，WT組和Faim2-KO組小鼠心臟切片蘇木精-伊紅染色的代表性圖像(n=5)；B.兩組平均橫截面積的定量結(jié)果，*P<0.05

2.3 Faim2敲除對(duì)壓力負(fù)荷所誘導(dǎo)的心肌纖維化的影響

心臟切片的天狼星紅染色結(jié)果顯示，在 TAC手術(shù) 4周后，F(xiàn)aim2-KO 小鼠的膠原沉積嚴(yán)重，心肌纖維化程度要明顯強(qiáng)于 WT 組(圖3)。

注：A.TAC術(shù)后4周，WT和Faim2-KO小鼠心臟橫切面天狼星紅染色的代表性圖像(n=5)。標(biāo)尺，100 μm；B：兩組左心室間質(zhì)膠原容積的定量結(jié)果,*P<0.05

3 討論

本研究構(gòu)建了Faim2基因敲除小鼠，并以其與WT為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)4周后衡量通過超聲及組織病理學(xué)檢測(cè)了Faim2對(duì)于壓力誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚的作用。Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)aim2基因敲除小鼠構(gòu)建成功，且Faim2敲除后，實(shí)驗(yàn)組小鼠室壁變厚、心肌細(xì)胞增大、心肌膠原沉積增多。以上結(jié)果表明，F(xiàn)aim2的缺失進(jìn)一步加重了病理性心肌肥厚的發(fā)展。

作為跨膜BAX抑制劑1母體(TMBIM)家族的一員，F(xiàn)aim2在細(xì)胞凋亡和壞死中發(fā)揮抑制作用[12]。以往的研究證實(shí)，F(xiàn)aim2通過與Fas受體直接相互作用，以及通過與Bcl-xl相互作用調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣的釋放來保護(hù)Fas，保護(hù)神經(jīng)元免受死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并參與軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元可塑性[13]。但是關(guān)于Faim2其他的功能與作用機(jī)制卻沒有深入研究。事實(shí)上，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aim2是一種膜蛋白，定位于溶酶體上，并且通過與LC3相互作用介導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)[3]。自噬的特點(diǎn)是進(jìn)化上保守的過程，即溶酶體依賴的細(xì)胞質(zhì)組分和受損細(xì)胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和線粒體)的降解，以及消除細(xì)胞內(nèi)病原體[14]。并且自噬是病理性心肌肥厚的核心調(diào)節(jié)機(jī)制。在心臟中，自噬主要通過消除蛋白質(zhì)聚集體和受損的細(xì)胞器，保護(hù)心臟免受饑荒、局部缺血和過度的β-腎上腺素刺激，在細(xì)胞應(yīng)激過程中起促進(jìn)生存的作用，過度自噬或者是自噬失調(diào)都會(huì)引起細(xì)胞受損、心肌肥厚[15]?；贔aim2對(duì)自噬的調(diào)控以及前文的研究中Faim2對(duì)于其他心肌肥厚因素(如缺血和細(xì)胞損害)的影響，我們猜測(cè)Faim2可能通過調(diào)節(jié)自噬系統(tǒng)而達(dá)到改善心肌肥厚的作用，這也將是我們未來的工作方向。