華利忠 王海燕 馮志新 王 佳 袁 廳 甘 源 張 磊 邵國(guó)青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)(2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212400)

SPF(specific pathogen free)豬即無特定病原豬, 其特殊價(jià)值在于：無主要的傳染病、無垂直傳染性疾病、無人豬共患病、無對(duì)實(shí)驗(yàn)研究可能產(chǎn)生干擾的微生物[1]，不僅在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮著重要作用，也是生命科學(xué)研究、生物制品生產(chǎn)的重要實(shí)驗(yàn)材料和原材料，其質(zhì)量好壞直接關(guān)系到上述多方面研究成果的可靠性及準(zhǔn)確性[2],是高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬。我國(guó)的SPF豬按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 22914—2008-T指應(yīng)無豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)、豬肺炎支原體(mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)、豬胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、豬產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(Toxigenic pasteurella multocida，T+Pm)、流行性乙型腦炎病毒(japanese encephalitis virus,JEV)等共12種病原，且臨床檢測(cè)沒有豬口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)、非洲豬瘟(African swine fever,ASF)等15種病的豬。由于我國(guó)SPF豬的供應(yīng)還沒有產(chǎn)業(yè)化，數(shù)量有限，隨著生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特別是2018年非洲豬瘟傳入我國(guó)后[3]，我國(guó)高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬的缺口也越來越大。如何批量生產(chǎn)能夠在一定程度上替代SPF豬的高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬，是促進(jìn)我國(guó)生物醫(yī)藥及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的重要基礎(chǔ)條件。本研究通過供體母豬的管理，無菌接產(chǎn)方式和人工飼喂標(biāo)準(zhǔn)以及人工乳配方的優(yōu)化等方式，初步嘗試了一種以普通母豬為供體，分娩高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用仔豬的方法，成功獲得了豬主要疫病均為陰性的高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬，該方法的應(yīng)用推廣，可批量提供高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬，彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)用豬的缺口。

1 材料和方法

1.1 妊娠母豬選擇及處理

本實(shí)驗(yàn)分兩批動(dòng)物進(jìn)行，均選擇3～5胎次臨床健康經(jīng)產(chǎn)母豬。實(shí)驗(yàn)一為2頭二花臉母豬和2頭大白豬，實(shí)驗(yàn)二為5頭長(zhǎng)大二元母豬。上述母豬經(jīng)檢測(cè)均為PRRSV、PRV、PCV2以及Mhp陽(yáng)性母豬。上述母豬在前一次分娩14 d后肌肉注射PRRSV減毒活疫苗，21 d斷奶后隔離環(huán)境下封群飼養(yǎng)，并采用對(duì)應(yīng)的精液(二花臉×二花臉；大白豬×大白豬；長(zhǎng)大二元母豬×杜洛克公豬)人工授精。封閉飼養(yǎng)后第20天肌肉注射豬偽狂犬基因缺失苗，50 d后肌肉注射豬瘟兔化弱毒疫苗1次，分娩前1月肌肉注射豬圓環(huán)滅活苗1次。分娩前20 d拌料給藥：80%泰妙菌素250 g/t+15%金霉素2 000 g/t+電解多維400 g/t，連用2周。

1.2 人工乳

人工乳為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所自配奶粉，配方奶主要成分和含量見表1，并采用放射性同位素鈷60射線源輻照滅菌，輻照劑量為20 KGy。

表1 新生仔豬人工乳配方

1.3 主要試劑

CSFV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬gE蛋白(pseudorabies virus gE protein,PRV gE)抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和Mhp抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(愛德士生物科技公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)和Taq酶(TaKaRa公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)分兩次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)一：人工乳和市售嬰兒奶粉飼養(yǎng)無菌接產(chǎn)豬對(duì)比實(shí)驗(yàn)。無菌接產(chǎn)2頭二花臉母豬和2頭大白母豬，分娩時(shí)采用無菌接產(chǎn)方式接產(chǎn)仔豬，然后在隔離環(huán)境下人工飼喂，并隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組飼喂自配人工乳，對(duì)照組飼喂市售普通1段嬰兒奶粉。實(shí)驗(yàn)二：人工乳飼喂和母豬自養(yǎng)(母乳飼養(yǎng))對(duì)比實(shí)驗(yàn)。隔離飼養(yǎng)的5頭二元母豬，每頭無菌接產(chǎn)5頭三元仔豬(無菌接產(chǎn)的仔豬選擇第1、3、5、7、9頭出生仔豬)，隔離環(huán)境下采用人工乳人工喂養(yǎng)。剩余仔豬由母豬自繁自養(yǎng)。

1.5 無菌接產(chǎn)程序

母豬有分娩癥狀時(shí)采用聚維酮碘全身消毒，并在母豬后驅(qū)鋪上滅菌墊子。分娩時(shí)，接產(chǎn)人員穿上無菌工作服，消毒雙手后帶上無菌手套準(zhǔn)備接生。每接生一頭消毒一次。仔豬出生后立即放入37～40 ℃預(yù)熱的聚維酮碘內(nèi)，同時(shí)用無菌毛巾擦拭口中及體表黏液，斷臍，再轉(zhuǎn)入37 ℃保溫運(yùn)輸箱內(nèi)，迅速運(yùn)至另一隔離間的屏障系統(tǒng)內(nèi)。

1.6 仔豬的飼養(yǎng)管理

人工飼喂的仔豬，分別用對(duì)應(yīng)的人工乳和市售奶粉進(jìn)行飼養(yǎng)。飼喂方法：取1份人工乳(或奶粉)，加入7份40～45 ℃滅菌蒸餾水中，充分混勻后奶瓶飼喂。飼喂頻率及環(huán)境溫度根據(jù)仔豬日齡調(diào)整(表2)。其中1～7日齡，全部飼喂流質(zhì)的人工乳或奶粉，7日齡后統(tǒng)一逐步添加經(jīng)放射性同位素鈷60輻照過的仔豬教槽料，直到21日齡斷奶，全部改為教槽料。實(shí)驗(yàn)二中自繁自養(yǎng)的仔豬同樣在7日齡時(shí)開始教槽，21日齡斷奶，斷奶后母子分離，仔豬隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件等同實(shí)驗(yàn)組。

表2 各日齡階段仔豬人工飼喂次數(shù)及溫度控制

1.7 臨床癥狀觀察、體質(zhì)量測(cè)定及存活率統(tǒng)計(jì)

每天觀察所有仔豬的臨床癥狀，記錄。分別于21日齡和2月齡統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組的存活率。新生仔豬在接產(chǎn)后立即進(jìn)行初生重測(cè)定，并于21日齡斷奶時(shí)測(cè)定其斷奶重，并對(duì)比日增重差異。

1.8 病原及抗體的檢測(cè)

新生仔豬在21日齡斷奶時(shí)根據(jù)NY/T 541規(guī)定的方法進(jìn)行血樣、鼻拭子、扁桃體樣以及糞便樣品的采集。其中血清樣本進(jìn)行PRRSV、CFSV、PRVgE、PCV2、FMD和Mhp的抗體檢測(cè)以及PRRSV和PCV2病原檢測(cè)；鼻拭子進(jìn)行Mhp、APP以及T+Pm的病原檢測(cè)；扁桃體進(jìn)行CSFV和PRVgE的病原檢測(cè)；糞便進(jìn)行PEDV和TGEV的病原檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 無菌接產(chǎn)仔豬數(shù)量及分組情況

無菌接產(chǎn)情況，實(shí)驗(yàn)分組及數(shù)量見表3。其中實(shí)驗(yàn)一 一共無菌接產(chǎn)二花臉仔豬18頭以及純種大白仔豬19頭，所有仔豬在隔離環(huán)境下人工飼喂，并分為兩組。實(shí)驗(yàn)組為8頭二花臉和10頭大白豬，飼喂自配人工乳，對(duì)照組為10頭二花臉和9頭大白豬，飼喂市售普通1段嬰兒奶粉。實(shí)驗(yàn)二共分娩59頭仔豬，每窩按計(jì)劃無菌接產(chǎn)5頭三元仔豬，共25頭，作為實(shí)驗(yàn)組，飼喂人工乳，其余豬(34頭)作為對(duì)照組由母豬自繁自養(yǎng)。

表3 各個(gè)實(shí)驗(yàn)組仔豬數(shù)量及飼喂配方

2.2 臨床觀察及存活率統(tǒng)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)一中，對(duì)照組豬在2日齡時(shí)就出現(xiàn)了水樣腹瀉，黃色，5 d內(nèi)擴(kuò)散到全組，腹瀉率達(dá)到100%，迅速消瘦脫水，其中大白豬首例死亡出現(xiàn)在4日齡，二花臉豬首例死亡出現(xiàn)在6日齡。實(shí)驗(yàn)組豬在3日齡開始出現(xiàn)一過性腹瀉，黃色，并在5～6日齡后恢復(fù)，腹瀉數(shù)大白豬4頭，二花臉豬3頭。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在21日齡和2月齡的存活率統(tǒng)計(jì)見表3。由表3顯示實(shí)驗(yàn)組仔豬100%存活，而對(duì)照組僅存活10%左右。

實(shí)驗(yàn)二的腹瀉數(shù)和存活率統(tǒng)計(jì)見表4。由表4發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)腹瀉的數(shù)量每窩在1～3頭不等，但很快好轉(zhuǎn)，存活率達(dá)到了100%。而對(duì)照組僅1窩出現(xiàn)了2頭腹瀉，另1窩淘汰了1頭弱仔外，沒有出現(xiàn)其他異常，存活率幾乎也達(dá)到了100%。

表4 實(shí)驗(yàn)豬腹瀉數(shù)及21日齡存活率統(tǒng)計(jì)

2.3 體質(zhì)量變化

由于實(shí)驗(yàn)一的對(duì)照組死亡較多，體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)對(duì)比沒有意義。在本實(shí)驗(yàn)中，僅統(tǒng)計(jì)了實(shí)驗(yàn)二的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，結(jié)果見表5。由表5發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的平均初生重一致，分別為1.66和1.63 kg，但斷奶重差別較大，分別為5.05和7.48 kg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的日增重分別為0.16和0.28 kg/d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 實(shí)驗(yàn)二中實(shí)驗(yàn)豬體質(zhì)量和日增重

2.4 抗體檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)一所有的豬，所有檢測(cè)的抗體指標(biāo)均為陰性。而實(shí)驗(yàn)二中，所有實(shí)驗(yàn)組的抗體指標(biāo)均為陰性，但對(duì)照組斷奶豬PRRSV、CSFV、PRVgE、PCV2、FMD和Mhp的抗體陽(yáng)性率分別為63.6%、84.8%、100%、100%、100%以及90.9%(表6)。

表6 實(shí)驗(yàn)二抗體檢測(cè)結(jié)果

2.5 斷奶豬病原檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共20頭斷奶豬，經(jīng)檢測(cè)PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、Mhp、APP、T+Pm、PEDV和TGEV全為陰性。而實(shí)驗(yàn)二中實(shí)驗(yàn)組上述指標(biāo)也全是陰性，但在對(duì)照組的33頭斷奶仔豬中分別檢測(cè)出了2頭PRRSV陽(yáng)性，25頭PCV2陽(yáng)性，18頭Mhp陽(yáng)性以及1頭PEDV陽(yáng)性(表7)。

表7 實(shí)驗(yàn)二病原檢測(cè)結(jié)果

3 討論

SPF豬一般采用外科手術(shù)法獲取，其理論依據(jù)是：絕大多數(shù)豬病不能通過胎盤傳染給胎兒，手術(shù)法取胎后隔離器飼養(yǎng)人工飼喂仔豬可防止病原的水平傳播。然該技術(shù)對(duì)供體母豬要求高，操作相對(duì)復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高、不易推廣普及，所以很多研究轉(zhuǎn)向利用自然分娩法培育SPF豬，原理同手術(shù)法。丹麥、日本和臺(tái)灣也采用此法獲取初級(jí)SPF豬，并建立了SPF豬群。通過自然分娩，但不吃初乳(snatch-farrowed, porcine-colostrum-deprived, SF-pCD)仔豬的培育，獲得了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)用豬，并將其用于疾病模型的建立[4-5]。有研究[6]也做了初步的嘗試，凈化了PRV、弓形體以及PRRSV等多種病原。此外，胚胎移植技術(shù)也能生產(chǎn)SPF豬。其主要步驟是：無菌環(huán)境下回收胚胎，將胚胎用含有雙抗和抗真菌的新鮮培養(yǎng)基清洗后進(jìn)行移植，再通過無菌接產(chǎn)和隔離器飼養(yǎng)，可達(dá)到培育SPF豬的目的。有研究[7]利用這個(gè)技術(shù)成功培育了SPF五指山豬。但這個(gè)技術(shù)要求更高，也無法大面積推廣。

除SPF豬規(guī)定的病原外，PCV2的存在也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響，但去除PCV2相對(duì)困難。有研究采用屏障系統(tǒng)[8]，剖宮產(chǎn)和無菌接產(chǎn)技術(shù)培育了PCV陰性仔豬，但也存在轉(zhuǎn)陽(yáng)的情況。哈爾濱獸醫(yī)研究所已建立了該套技術(shù)體系，利用該技術(shù)從CSFV、FMD、PRRSV、JE、PRV、PCV2、PPV等陽(yáng)性母豬中接生到了全部為陰性的仔豬[2]。但是該技術(shù)并不能保證百分百可以剔除垂直傳播病原。本研究用普通母豬作為供體，在沒有剖宮產(chǎn)和手術(shù)取胚的情況下，通過無菌接產(chǎn)，隔離器飼養(yǎng)等多方面進(jìn)行病原控制，也達(dá)到了培育PRRSV、CSFV、PRV、PCV2等多種豬主要疫病病原全陰性實(shí)驗(yàn)用豬的目的。該方法主要原理和上述方法一致，但供體母豬廣泛，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，容易推廣。該方法相對(duì)剖宮產(chǎn)技術(shù)的主要風(fēng)險(xiǎn)在于阻斷垂直傳播更為困難。所以在實(shí)施無菌接產(chǎn)之前，對(duì)母豬的管理尤為重要，本實(shí)驗(yàn)通過選取3～5胎次的臨床健康經(jīng)產(chǎn)母豬為供體，實(shí)施封群和疫苗免疫，其目的就是盡可能的阻斷病原的垂直傳播，再通過無菌接產(chǎn)，屏障系統(tǒng)等措施，阻斷水平傳播，以達(dá)到凈化相關(guān)病原的目的。但由于本實(shí)驗(yàn)涉及的母豬數(shù)僅9頭，數(shù)量不多，目前還不能得出該技術(shù)能100%成功的結(jié)論，所以，在批量生產(chǎn)時(shí)，需建立小單元的屏障系統(tǒng)，以減少仔豬在飼養(yǎng)過程中，部分病原大面積轉(zhuǎn)陽(yáng)的風(fēng)險(xiǎn)。

在人工飼喂過程中，腹瀉是仔豬存活率的一大風(fēng)險(xiǎn)。腹瀉的主要因素有仔豬胃腸道的發(fā)育不全、人工乳的營(yíng)養(yǎng)以及大腸桿菌等。本研究?jī)?yōu)化了人工乳的配方，提供了相對(duì)全面的營(yíng)養(yǎng)以及多種抗腹瀉和提高免疫力的原料，大大降低了仔豬的腹瀉率，這也是保證本實(shí)驗(yàn)所培育的仔豬存活率大大提高的原因之一。在體質(zhì)量方面，相比母豬自繁自養(yǎng)的仔豬，人工培育的仔豬體質(zhì)量相對(duì)較輕，那是人工喂養(yǎng)時(shí)由于勞動(dòng)力等因素，仔豬采食的頻率沒有自繁自養(yǎng)的高，再加上少數(shù)幾頭豬一過性的腹瀉，對(duì)日增重有所影響。而由于每窩移走了5頭仔豬，母豬自帶的仔豬相對(duì)較少，所能獲得的母乳相對(duì)充足，又未發(fā)生腹瀉等疾病，故日增重相對(duì)較大。

通過供體母豬的管理，無菌接產(chǎn)，人工乳的優(yōu)化，屏障系統(tǒng)內(nèi)人工喂養(yǎng)的系列措施，可實(shí)現(xiàn)以普通母豬為供體，培育出豬主要疫病均為陰性的高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬。該方法可在沒有現(xiàn)成SPF母豬的前提下，建立了一種科學(xué)、有效、簡(jiǎn)便的高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)用豬的生產(chǎn)技術(shù)，為我國(guó)優(yōu)質(zhì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的產(chǎn)業(yè)化提供了臨床經(jīng)驗(yàn)和理論依據(jù)。