施國(guó)榮 劉婷婷 田 欣 祝自新 鄭文榮 王宇峰 孫芳玲 王 文,3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京 100053)(2.北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)(3.北京腦重大疾病研究院腦卒中研究所，北京 100053)

缺血性卒中是世界范圍內(nèi)成人殘疾和死亡的主要原因之一[1]。大多數(shù)幸存患者由于神經(jīng)功能缺陷和障礙，導(dǎo)致生活質(zhì)量的降低。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，73.88%的首次卒中幸存者和55.75%的慢性卒中患者出現(xiàn)上肢運(yùn)動(dòng)障礙[2]。卒中的康復(fù)治療是一個(gè)復(fù)雜的過程，受限于對(duì)影響腦功能重塑機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足以及我國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)發(fā)展起步較晚，目前亟需有效的卒中臨床康復(fù)治療手段。

作為基于腦的物理刺激干預(yù)，腦深部電刺激(deep brain stimulation, DBS)可能為卒中患者尤其是有嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙的患者，提供功能恢復(fù)的機(jī)會(huì)[3]。目前大多數(shù)卒中后遺癥的DBS治療主要集中在神經(jīng)性疼痛，只有少數(shù)病例報(bào)告使用DBS治療運(yùn)動(dòng)障礙[4-5]。然而，這些有限的數(shù)據(jù)表明，腦深部電刺激有可能改善卒中后的運(yùn)動(dòng)功能。最近的研究表明，用電或光遺傳學(xué)方法刺激小腦外側(cè)核可以促進(jìn)卒中后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[6]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)皮層缺血1 周或1 個(gè)月后電刺激小腦外側(cè)核(lateral cerebellar nucleus，LCN)DBS可促進(jìn)梗死側(cè)SVZ區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，減少梗死體積[7]。

電生理技術(shù)的應(yīng)用為神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞活動(dòng)提供客觀的數(shù)據(jù)。其中在體大腦局部場(chǎng)電位(local field potential，LFP)記錄通過記錄大群神經(jīng)細(xì)胞活性，監(jiān)測(cè)距離記錄電極最近的空間加權(quán)低頻活動(dòng)，體現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中高度動(dòng)態(tài)信息流[8]。因此LFP記錄已被用于識(shí)別神經(jīng)疾病的病理變化，檢測(cè)進(jìn)行性神經(jīng)障礙的損傷程度，甚至可能提供與外顯行為效應(yīng)相對(duì)應(yīng)的生理標(biāo)志物，同時(shí)也為在體評(píng)估針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性的治療手段提供客觀準(zhǔn)確的方法[9-10]。本實(shí)驗(yàn)通過在體記錄大鼠大腦皮層的神經(jīng)電生理信號(hào)，觀察內(nèi)皮素-1(endothelin 1,ET-1)誘導(dǎo)局灶性腦缺血大鼠模型皮層LFP的變化，探討LCN DBS治療對(duì)皮層神經(jīng)元活動(dòng)的影響，為L(zhǎng)CN DBS再生修復(fù)治療卒中提供了新的客觀證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑：藥物與試劑內(nèi)皮素-1(默克公司)、1.27 mm 2×40 p排針(深圳市連譽(yù)德科技有限公司)、1.27 mm 2×40 p排母(深圳市連譽(yù)德科技有限公司)、外徑0.9 mm特氟龍鍍銀導(dǎo)線(上海鴻鵬電線電纜有限公司)、內(nèi)徑0.076 mm外徑0.114 mm 特富龍絕緣鎢絲(Plexon公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)別260～280 g雄性SD大鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證【SCXK(京)2021-0008】，合格證號(hào)【11804700015271】。術(shù)前過夜禁食不禁水。采用內(nèi)皮素-1注射大腦皮層誘導(dǎo)局灶性缺血模型，術(shù)后休息一周，第7 天安裝電極，電極安裝完成后隨機(jī)分為模型組和DBS組，每組3 只。

1.2 方法

1.2.1模型制備：采用ET-1定點(diǎn)注射大鼠右側(cè)皮層誘導(dǎo)局灶性腦缺血模型。雄性大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(1%戊巴比妥鈉溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，43 mg/kg)后，使用立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)固定。碘伏消毒大鼠頭部中線處皮膚，大鼠中線做切口以暴露顱骨，并在相對(duì)于前囟的如下坐標(biāo)處鉆3個(gè)小孔：(1)AP(anterior-posterior,前后側(cè))=-1.0 mm, ML(medial-lateral, 內(nèi)外側(cè))=-2.5 mm, DV(dorso-ventral,背腹側(cè))=-2.3 mm;(2)AP= +1.0 mm, ML=-2.5 mm, DV=-2.3 mm;(3)AP= +3.0 mm, ML=-2.5 mm, DV=-2.3 mm。ET-1溶于無菌0.9%氯化鈉溶液中，每孔注入800 pmol/2 μL。術(shù)后將大鼠置于37 ℃的加熱板上，待從麻醉中醒來，運(yùn)送回籠子里。

1.2.2小腦外側(cè)核深部電刺激：局灶性腦缺血后第7 天，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠(1%戊巴比妥鈉溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，43 mg/kg)，然后固定在立體定位框架上。碘伏消毒大鼠頭部中線處皮膚，大鼠中線做切口以暴露顱骨，在大鼠的小腦外側(cè)核進(jìn)行打孔，相對(duì)于前囟的坐標(biāo)為：AP=-11.0 mm, ML=+3.6 mm, DV=-6.3 mm安裝刺激電極；在大鼠的皮層上方打孔，相對(duì)于前囟的坐標(biāo)為(1)AP=-2 mm, ML=+3.0 mm，DV=-1 mm(2)AP=-2 mm, ML=-3.0 mm，DV=-1 mm安裝記錄電極，(3)AP=-8 mm, ML=-2 mm，DV=0 mm安裝基線和地線。安裝完成后用牙托水泥進(jìn)行固定[11]。DBS組每天給予8 h的30 Hz電刺激，連續(xù)14 d。

1.2.3電生理記錄：分別在缺血模型后第7和21天，進(jìn)行誘導(dǎo)局部場(chǎng)電位記錄。戊巴比妥鈉麻醉大鼠后(1%戊巴比妥鈉溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，43 mg/kg)，刺激大鼠的左前肢10 s一次，重復(fù)30 次(10 hz，2.5 mA，3 次脈沖電流，每次脈沖刺激包括：刺激2 ms，延遲32 ms，刺激2 ms，延遲64 ms),同時(shí)采用OmniPlex在體多通道記錄系統(tǒng)(Plexon公司)連續(xù)記錄30次脈沖刺激的局部場(chǎng)電位信號(hào)。從第7次刺激開始到第30 次的每次刺激之后的0.5～9 s進(jìn)行分析。同時(shí)分析了每個(gè)頻帶信號(hào)的患側(cè)-健側(cè)功率比：Theta(3～10 Hz), Alpha(8～14 Hz), Beta-1(15～20 Hz), Beta-2(20～35 Hz)和Gamma(35～90 Hz)。

2 結(jié)果

2.1 LCN DBS 對(duì)誘發(fā)皮層LFP平均功率的影響

ET-1定點(diǎn)注射誘導(dǎo)皮層缺血7和21 d，患側(cè)皮層的誘發(fā)神經(jīng)元活性顯著降低，約為健側(cè)皮層的37.8%和41.5%(P<0.001，P<0.01)(圖1)。給予14 d LCN DBS治療后，患側(cè)皮層平均功率雖然低于健側(cè)水平(P<0.001)，但比刺激前顯著增加86.8%(P<0.001)，比模型組21 d的患側(cè)平均功率增加79.2%。給予14 d LCN DBS治療后，刺激后健側(cè)相較于刺激前也有所增加(P<0.01)(圖2)。

圖1 缺血后7、21 d模型組和DBS組的代表性局部場(chǎng)電位圖

注：*P <0.01，**P<0.001

2.2 LCN DBS 對(duì)不同頻帶LFP功率的影響

模型組各波段的患側(cè)/健側(cè)功率比值缺血后21 d與缺血7 d相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而DBS治療后，Theta波、Alpha波和Beta-1波患側(cè)/健側(cè)功率比值與治療前相比均有顯著提高(P<0.05，P<0.01)，表明DBS對(duì)這些波段神經(jīng)興奮性有改善作用。Beta-2波和Gamma波組間無顯著差異，表明DBS對(duì)其無明顯作用(圖3)。

注：A.Theta波(3～10 Hz)；B.Alpha波(8～14 Hz)；C.Beta-1波(15～20 Hz)；D.Beta-2波(20～35 Hz)；E.Gamma波(35～90 Hz),*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

DBS是一種新型神經(jīng)調(diào)節(jié)方式，需要在腦實(shí)質(zhì)中植入刺激電極，通過所連接的脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)，將電脈沖傳遞到目標(biāo)大腦結(jié)構(gòu)，用來調(diào)節(jié)局部和遠(yuǎn)程功能失調(diào)的大腦回路[11]。DBS的電刺激傳遞是可逆的和可編程的，刺激模式可以是連續(xù)的或間歇的，刺激參數(shù)(頻率、脈寬、電壓)可調(diào)，刺激位點(diǎn)范圍廣泛，幾乎在大腦的任何地方使用[3]。因此，DBS目前作為一種安全有效的運(yùn)動(dòng)障礙治療方法，在帕金森病、特發(fā)性震顫和肌張力障礙等疾病治療中有很好的臨床應(yīng)用[12]。研究表明，DBS對(duì)減輕卒中后疼痛、肌張力障礙、痙攣等也有較好的效果[12]。但是目前DBS在改善卒中運(yùn)動(dòng)功能方面的研究較少。另外，DBS刺激靶點(diǎn)的選擇對(duì)于疾病至關(guān)重要。神經(jīng)影像學(xué)和電生理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)小腦-丘腦-皮層(dentate thalamo cortical,DTC)通路在運(yùn)動(dòng)恢復(fù)中的重要作用[13]。小腦外側(cè)核作為該興奮性通路的起點(diǎn)，將興奮性神經(jīng)輸出經(jīng)丘腦發(fā)送到對(duì)側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)，包括初級(jí)運(yùn)動(dòng)區(qū)和腹側(cè)前運(yùn)動(dòng)皮層，以及非運(yùn)動(dòng)區(qū)背外側(cè)前額葉皮層[13]。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)LCN進(jìn)行光遺傳學(xué)刺激可以持續(xù)性恢復(fù)卒中后運(yùn)動(dòng)功能[6]。最近的一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)有13 位卒中后運(yùn)動(dòng)障礙患者在LCN DBS治療后癥狀有明顯的改善[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后給予30 Hz LCN DBS可促進(jìn)SVZ內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能，也進(jìn)一步證實(shí)LCN很有可能作為卒中DBS治療改善運(yùn)動(dòng)功能的靶點(diǎn)[7]。

電生理研究在DBS治療中評(píng)價(jià)神經(jīng)元功能至關(guān)重要。腦內(nèi)LFP通過記錄電極周圍群體神經(jīng)元放電活動(dòng)-突觸跨膜電流產(chǎn)生的細(xì)胞場(chǎng)勢(shì)，來直觀衡量大腦神經(jīng)元活性，反映神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中高度動(dòng)態(tài)的信息流動(dòng)，為疾病機(jī)制和認(rèn)知過程提供更有價(jià)值的見解[15]。本研究采用電生理采集系統(tǒng)記錄大鼠雙側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層LFP信號(hào)，考察電刺激小腦外側(cè)核對(duì)皮層神經(jīng)元興奮性的影響。有研究顯示ET-1誘導(dǎo)局灶性腦缺血損傷后，梗死周圍區(qū)域的平均神經(jīng)元活動(dòng)衰減約50%[16]。本研究結(jié)果顯示，在ET-1注射誘導(dǎo)局灶性腦缺血后7和21 d，患側(cè)的LFP顯著低于健側(cè)，提示局灶性腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元活動(dòng)衰減，與之前報(bào)道一致。給予對(duì)側(cè)LCN DBS 刺激，患側(cè)皮層LFP顯著升高，表明LCN DBS具有增強(qiáng)神經(jīng)元活性的作用。LCN DBS也導(dǎo)致電刺激同側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層LFP的升高，表明電刺激激活DTC通路興奮性傳導(dǎo)在大腦半球之間存在交聯(lián)。神經(jīng)元活動(dòng)復(fù)雜，具有頻譜特異性，不同的震蕩頻率具有不同的功能。因而我們用基于不同頻帶來分析LFP結(jié)果，將能更好地理解DBS治療的機(jī)制。Theta波(3～10 Hz)和alpha波(8～14 Hz)都屬于低頻波段，稱為低頻波(low frequency,LF)[16]。LF通常被認(rèn)為與認(rèn)知和情緒有關(guān)，包括沖突判斷、經(jīng)濟(jì)決策、沖動(dòng)控制、獎(jiǎng)勵(lì)相關(guān)加工、記憶功能、注意和意識(shí)、模糊感知辨別、言語(yǔ)生成和抑郁[17]。此外，LF也被發(fā)現(xiàn)與運(yùn)動(dòng)障礙相關(guān)[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)LCN DBS刺激后LF的功率上升，這與運(yùn)動(dòng)功能改善相一致。Beta波一般被劃分為高Beta波(Beta-1，15～20 Hz)和低Beta波(Beta-2，20～35 Hz)。Beta-1波通常被認(rèn)為與步態(tài)障礙有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)LCN DBS刺激后Beta-1得到改善[19]。Beta-2波通常被認(rèn)為與力量有關(guān)，LCN DBS刺激則對(duì)其沒有作用[20-22]。Gamma波通常被認(rèn)為與神經(jīng)元的異常放電有關(guān)，在本研究中也對(duì)LCN DBS不敏感[23]。我們前期證實(shí)LCN DBS能增加面條矩陣抓取任務(wù)中大鼠前肢抓取面條數(shù)量和擴(kuò)大在矩陣的分布，減少不規(guī)則水平梯子行走實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)格漏空實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)誤步數(shù)，增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，縮小梗死體積[7]。本研究中LCN DBS對(duì)LFP不同波段功率的影響與改善運(yùn)動(dòng)功能的作用相吻合，為L(zhǎng)CN DBS治療腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能障礙提供客觀證據(jù)，同時(shí)該研究也為運(yùn)動(dòng)功能的客觀評(píng)價(jià)提供可靠的方法。

綜上可見，ET-1定點(diǎn)注射誘導(dǎo)局灶性腦缺血后，皮層局部場(chǎng)電位降低，神經(jīng)元活動(dòng)減弱，而LCN DBS激活DTC通路對(duì)皮層神經(jīng)元的興奮性有改善作用。結(jié)合前期行為學(xué)研究和組化研究結(jié)果，LCN DBS很可能成為治療卒中運(yùn)動(dòng)功能障礙的有效方法。LFP只能采集局部皮層下神經(jīng)元電活動(dòng)的情況，我們后續(xù)將采用磁共振成像分析等技術(shù)進(jìn)一步完善神經(jīng)纖維追蹤，構(gòu)建LCN DBS治療的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖譜，更好地理解DBS改善運(yùn)動(dòng)功能的機(jī)制。