李 威 石紅杰 周 妍 胡宇峰 夏 豪

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430060)(2.武漢大學(xué)模式動(dòng)物研究所，武漢 430071)

病理性心肌肥厚是多種心血管疾病的重要臨床階段，其主要原因?yàn)闄C(jī)械性或體液性因素導(dǎo)致的壓力負(fù)荷持續(xù)性增大，造成心肌細(xì)胞肥大以及心肌間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致心臟功能嚴(yán)重受損，以及不可逆轉(zhuǎn)的病理性心臟重構(gòu)和心力衰竭[1]。在病理性心臟重構(gòu)過程中，多種基因及信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)控心肌肥厚和纖維化病理生理過程[2-5]。Smyd2屬于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD家族，通過基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[6]。Smyd2是最廣泛研究的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶之一，它可以甲基化修飾組蛋白H3K6、H3K4以及其他非組蛋白靶標(biāo)，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7]。此前研究表明，Smyd2通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)多種腫瘤，如肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌等的發(fā)生發(fā)展[8-10]。此外，Smyd2在心臟組織中高度表達(dá)，目前的研究對(duì)于Smyd2在心臟中的功能知之甚少[11]。對(duì)于Smyd2在病理性心肌肥厚中的作用尚不明確。因此，本研究成功構(gòu)建了Smyd2基因敲除的小鼠，并建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚模型，以探究Smyd2在心肌肥厚和纖維化中的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選用8～10周齡、體質(zhì)量24～26 g、C57BL/6背景的雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。Smyd2基因敲除(Smyd2-KO)小鼠為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，對(duì)照組為C57BL/6背景的雄性同窩對(duì)照小鼠(WT)。小鼠的飼養(yǎng)和繁殖均在武漢大學(xué)模式動(dòng)物研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(鄂)2019-0004】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(鄂)2019-0013】。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并獲得倫理批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)【W(wǎng)DRM動(dòng)(福)第20201206號(hào)】。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

戊巴比妥鈉(Sigma Aldrich公司，P3761)、細(xì)胞核染料(Southern Biotech公司，0100-20)、蘇木精染液(谷歌生物公司，G1004)、伊紅染料(BASO公司，BA-4024)、天狼星紅染料(海德創(chuàng)業(yè)生物科技公司，26357-02)、MEGAshortscript試劑盒(Ambion公司，AM1345)、miRNeasy Micro Kit(Qiaen公司，217084)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具(蘇杭科技器材有限公司)、溫控手術(shù)臺(tái)(WPI公司，ATC100)、臺(tái)式離心機(jī)(Thermo公司，LEGNED MICRO17)、多功能脫色搖床(上海智誠公司，ZWY-344)、凝膠成像系統(tǒng)(伯樂公司，Gel DocTM)、PCR儀(ABI公司，Verti)。

1.4 Smyd2基因敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定

Smyd2基因敲除小鼠運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建。首先，在http://crispr.mit.edu上在線預(yù)測(cè)小鼠Smyd2的引導(dǎo)序列并設(shè)計(jì)了兩條sgRNA，sgRNA1∶5’-GATGCCGGGATGCGGATATAGGG-3’，sgRNA2∶5’-GTGGCTGGGGATCATGCCGAGGG-3’。通過引物退火得到雙鏈DNA，將雙鏈DNA克隆到pUC57-sgRNA(Addgene，51132)載體上，然后以上述載體為模板通過PCR擴(kuò)增得到含有T7啟動(dòng)子及引導(dǎo)序列的DNA片段。擴(kuò)增使用引物為正向引物：5’-GATCCCTAATACGACTCACTATAG-3’，反向引物：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’。以上述步驟得到的PCR產(chǎn)物和Cas9質(zhì)粒(Addgene，44758)作為模板用MEGAshortscript試劑盒(Ambion，AM1345)分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA用miRNeasy Micro Kit(Qiaen，217084)純化后通過FemtoJet5247顯微注射系統(tǒng)注射到野生型C57BL/6小鼠的單細(xì)胞受精卵內(nèi)。選取經(jīng)顯微注射后存活的受精卵移植到健康雌鼠輸卵管中，妊娠得到F0代小鼠。將F0代小鼠和野生型C57BL/6小鼠雜交得到F1代小鼠，然后用PCR鑒定小鼠基因型，將雜合子雜交并鑒定篩選得到純合子小鼠。PCR鑒定引物為：Smyd2-正向：5’-CTTCCCATCTCAAACGGTTC-3’，Smyd2-反向：5’-AACTTGGCTGATGGTGTCCT-3’。本研究中所用小鼠均為純合子。

1.5 動(dòng)物模型建立

分別將10只WT和Smyd2-KO的小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(TAC)，建立壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型[12-14]。首先，用3%戊巴比妥腹腔注射進(jìn)行小鼠麻醉，沿第2～3肋間切開皮膚并分離肌肉以及軟組織，然后用解剖剪剪斷右鎖骨，游離主動(dòng)脈弓，隨后用7-0手術(shù)縫線穿過26 G墊針結(jié)扎主動(dòng)脈。依次縫合切口，將小鼠置于恒溫箱中，蘇醒后將小鼠放回于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。

1.6 超聲檢測(cè)

TAC術(shù)后4周，用異氟烷麻醉小鼠后，將小鼠固定為左側(cè)臥位或仰臥位，在左胸前區(qū)做剃毛處理，然后涂抹超聲耦合劑在剃毛區(qū)。采用高頻超聲診斷儀設(shè)置超聲頻率為15 MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左室乳頭肌短軸切面進(jìn)行超聲檢測(cè)，測(cè)量并計(jì)算左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、短軸縮短率以及射血分?jǐn)?shù)。

1.7 組織病理學(xué)檢測(cè)

超聲檢測(cè)完成后，稱重后處死小鼠，快速取出心臟組織，用10倍體積的4%多聚甲醛固定24 h，切除心房組織，依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片處理。隨后分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和天狼星紅(PSR)染色，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞橫截面積和心肌纖維化的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Smyd2基因敲除小鼠的鑒定

Smyd2基因敲除小鼠采用CRISPR-Cas9技術(shù)，在Smyd2基因組DNA的第二個(gè)外顯子兩端分別設(shè)計(jì)2個(gè)sgRNA，以切割刪除包含第二個(gè)外顯子的部分，構(gòu)建示意圖見圖1A?；蚓庉嬓∈蟪晒?gòu)建后，取鼠尾組織基因組進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果如下圖：WT小鼠鑒定的PCR產(chǎn)物大小為2 096 bp，刪除掉Smyd2的第二個(gè)外顯子后，Smyd2-KO鑒定的PCR產(chǎn)物為1 411 bp(圖1B)。證明成功構(gòu)建Smyd2敲除的純合子小鼠。

注：A.C57/6J小鼠Smyd2基因示意圖，sgRNA靶位點(diǎn)用紅色箭頭表示。F1：PCR鑒定正向引物，R1：PCR鑒定反向引物。B.小鼠鼠尾鑒定 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。WT：wild-type C57小鼠，Smyd2-KO：Smyd2基因敲除小鼠。

2.2 Smyd2基因敲除對(duì)心臟功能的影響

為了明確Smyd2在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用，本研究檢測(cè)了Smyd2基因敲除對(duì)心臟功能的影響。超聲結(jié)果表明，TAC手術(shù)4周后，Smyd-KO組的左室舒張末期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑均顯著高于WT組，而射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率顯著低于WT組(P<0.05)(表1)。表明Smyd2基因敲除促進(jìn)了壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心臟功能受損。

表1 TAC手術(shù)4周后各組超聲檢測(cè)結(jié)果的比較

2.3 Smyd2基因敲除對(duì)心肌肥厚的影響

HE染色結(jié)果顯示，TAC手術(shù)4周后，Smyd2-KO組小鼠較WT組心臟體積明顯增大(圖2)，定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Smyd2-KO組心肌細(xì)胞面積(503.77±24.78)較WT組(334.91±22.37)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明Smyd2基因敲除顯著加重了壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚。

圖2 TAC手術(shù)4周后各組小鼠心臟組織HE染色

2.4 Smyd2基因敲除對(duì)心臟纖維化的影響

PSR染色結(jié)果顯示，TAC手術(shù)4周后，與WT組相比較，KO組心臟纖維化程度明顯加重(圖3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，KO組心肌膠原纖維含量(3.63±1.25)%較WT組(1.40±0.34)%明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，Smyd2基因敲除顯著加重了壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心臟纖維化。

圖3 TAC手術(shù)4周后各組小鼠心臟組織PSR染色的代表性圖片

3 討論

心肌肥厚是心臟對(duì)各種生理刺激和病理損傷導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷增大的代償性應(yīng)答，其主要特征為心臟重量增大，心肌細(xì)胞肥大，蛋白質(zhì)合成增多[1]。代償期心肌肥厚表現(xiàn)出適應(yīng)性的心臟收縮能力增強(qiáng)，心臟輸出量維持正常。但是，長期的持續(xù)性的心肌肥厚常會(huì)進(jìn)展為心力衰竭，并且最終導(dǎo)致心血管相關(guān)病死率顯著增加[15]。此外，抑制心肌肥厚的病理進(jìn)展能有效降低心力衰竭發(fā)病率和死亡率[16]。因此，迫切需要更多研究深入了解心肌肥厚促發(fā)機(jī)制以及抗肥厚的保護(hù)性分子。以期未來能夠開發(fā)特異性的分子有效抑制心肌肥厚的疾病進(jìn)展。

本研究選用Smyd2-KO小鼠為研究對(duì)象，通過主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)建立心肌肥厚模型，術(shù)后4周分別通過超聲檢測(cè)心臟功能、組織病理學(xué)檢測(cè)心肌肥厚和纖維化，全面評(píng)估了Smyd2敲除對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚的影響。結(jié)果顯示Smyd2敲除后，壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心臟功能受損明顯加重，并且病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示，Smyd2敲除顯著加重了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚和心臟纖維化。這些結(jié)果一致表明，Smyd2敲除促進(jìn)了病理性心肌肥厚和心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。此前的研究表明，Smyd2在心臟和腦組織中具有較高的表達(dá)豐度，并且Smyd2在心臟發(fā)育過程中差異表達(dá)[11]。然而，有研究表明，Smyd2的心臟特異性敲除并不會(huì)影響心臟的正常發(fā)育以及功能，但是能夠有效調(diào)控翻譯相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[17]。這提示Smyd2并不影響正常心臟生理過程，而可能在多種心臟病理應(yīng)激過程中發(fā)揮作用，如心肌梗死、心肌缺血、心肌肥厚等。本研究證實(shí)了敲除Smyd2不影響生理?xiàng)l件下的心臟功能，而加重了肥厚心臟的心臟功能受損。這提示Smyd2有潛力成為一個(gè)病理性心肌肥厚中有效的治療靶標(biāo)。

在正常水平以及壓力負(fù)荷水平下，心肌細(xì)胞的功能維持需要一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制基因表達(dá)。壓力的不同類型和持續(xù)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變，進(jìn)而影響心臟表型改變，最終導(dǎo)致心力衰竭[18]。Smyd2作為一個(gè)研究廣泛的甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠有效調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程[6]。Smyd2在心臟功能維持以及心肌肥厚中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用目前還不夠清楚。本研究觀察到Smyd2基因敲除促進(jìn)心肌肥厚的疾病進(jìn)展，但是并未深入探討Smyd2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，后續(xù)需進(jìn)一步深入探究Smyd2在心肌肥厚中的具體機(jī)制。