曹禮慧，劉麗娟，袁中文，高珊珊，馮森玲

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510150）

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一。近年來其發(fā)生率和病死率不斷升高，發(fā)病原因尚未完全明確，治療方法主要是手術(shù)和放化療[1]。迷迭香酸是一種天然多功能酚酸類化合物，因1958年首次從迷迭香植物中分離提取而得名[2]。研究[3-4]表明，迷迭香酸具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎和抗菌等，對(duì)肝癌、卵巢癌、宮頸癌等均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。本研究通過數(shù)據(jù)庫篩選出迷迭香酸的作用靶點(diǎn)，探索迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，為后續(xù)開展分子生物學(xué)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 迷迭香酸靶點(diǎn)的篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、比較毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD，https://ctdbase.org/）獲取迷迭香酸的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。去除重復(fù)后篩選得到迷迭香酸的靶點(diǎn)。

1.2 子宮內(nèi)膜癌相關(guān)靶點(diǎn)的檢索

以“endometrial carcinoma”“endometrial cancer”為檢索詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/）獲取子宮內(nèi)膜癌的作用靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)去重后得到子宮內(nèi)膜癌的靶點(diǎn)。

1.3 迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.1”中迷迭香酸的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與“1.2”中子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)輸入STRING 11.5在線數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）對(duì)靶點(diǎn)間蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）進(jìn)行分析。物種選擇“Homo sapiens”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，從而得到PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，利用Cytoscape的CytoHubba中Maximal Clique Centrality（MCC）拓?fù)浞治龇椒?gòu)建迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

使用Metascape在線數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。再根據(jù)P值排序進(jìn)行可視化分析。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

使用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www1.rcsb.org/）下載迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌靶點(diǎn)的PDB格式文件，并用PyMOL刪除多余蛋白小分子和配體，再使用TCMSP平臺(tái)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）下載迷迭香酸有效化學(xué)成分的mol2軟件文件。通過AutoDock中的AutoGrid和AutoDock兩個(gè)程序，分別進(jìn)行格點(diǎn)中相關(guān)能量的計(jì)算和構(gòu)象搜索與評(píng)價(jià)，預(yù)測(cè)最佳的結(jié)合模式。

2 結(jié)果

2.1 迷迭香酸的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP可以得到迷迭香酸的藥理和分子特性信息，見表1。從TCMSP和CTD中共獲取迷迭香酸作用靶點(diǎn)76個(gè)，見表2。

表1 迷迭香酸的藥理和分子特性

表2 迷迭香酸的靶點(diǎn)

2.2 子宮內(nèi)膜癌相關(guān)靶點(diǎn)的檢索

通過檢索GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫共獲得子宮內(nèi)膜癌相關(guān)靶點(diǎn)4 052個(gè)。

2.3 迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)

將迷迭香酸與子宮內(nèi)膜癌的靶點(diǎn)取交集，共獲得67個(gè)交集靶點(diǎn)。利用STRING 11.5在線數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)間蛋白相互作用進(jìn)行分析，得到PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1A。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，獲得前10個(gè)hub蛋白，由此推測(cè)JUN、TNF、IL-6、PTGS2、MMP-9、CASP3、AKT1、IL-1B、MAPK3、CCL2靶點(diǎn)可能為迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖1B。

圖1 迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的集靶點(diǎn)

2.4 迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的GO生物學(xué)功能富集分析

GO富集分析共有條目1 422條，包括生物過程（biological process，BP）1 302條、細(xì)胞組成（cellular component，CC）44條和分子功能（molecular function，MF）76條。根據(jù)P值大小展示前10條GO條目，見表3、圖2。根據(jù)結(jié)果顯示，脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)、細(xì)菌反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、氧活性反應(yīng)為最明顯的生物過程，可能是迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌潛在最重要的生物過程。

圖2 GO富集分析柱狀圖

表3 GO富集分析結(jié)果

2.5 迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的KEGG通路富集分析

KEGG富集分析通路共271條。根據(jù)P值大小展示前20條通路，見表4。糖尿病并發(fā)癥AGERAGE信號(hào)通路、查加斯病、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路是最為顯著的信號(hào)通路，可能是迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌最重要的作用通路。其他通路還有百日咳、乙型肝炎等，氣泡圖見圖3，KEGG靶點(diǎn)-通路見圖4。

圖3 KEGG富集分析氣泡圖

圖4 KEGG靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表4 KEGG富集分析結(jié)果

2.6 迷迭香酸與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

對(duì)迷迭香酸與PPI拓?fù)洚悩?gòu)分析結(jié)果中10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。一般認(rèn)為，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定時(shí)能量越低，結(jié)合作用越大，多數(shù)研究以結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1（約為-1.2 kcal·mol-1）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)結(jié)合能≤-7.0 kJ·mol-1（約為-1.7 kcal·mol-1）時(shí)，結(jié)合作用更大。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸與10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合力，其中與MMP-9結(jié)合作用最大，其次是AKT1，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，說明MMP-9和AKT1可能是迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的潛在主要靶點(diǎn)，見表5。采用PyMOL軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白與成分對(duì)接的最佳構(gòu)象進(jìn)行可視化分析，見圖5。

圖5 迷迭香酸與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

表5 迷迭香酸與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

3 討論

迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)為JUN、TNF、IL-6、PTGS2、MMP-9、CASP3、AKT1、IL-1B、MAPK3、CCL2。其中，MMP-9即結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶-9，在女性機(jī)體癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[5-6]，通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，使癌細(xì)胞通過部分缺失的細(xì)胞外基質(zhì)向周圍組織浸潤，造成癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。子宮內(nèi)膜癌中MMP-9的表達(dá)情況可以提示患者的子宮內(nèi)膜癌惡性程度，MMP-9表達(dá)較高者，腫瘤惡性程度高，易于浸潤轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后差[7-8]。AKT1是AKT的重要亞型之一，AKT能夠通過磷酸化及其下游的多種作用底物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，抑制細(xì)胞凋亡，在多種腫瘤組織中都存在AKT的過度表達(dá)和活化[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，AKT1可在人胃癌和乳腺癌中發(fā)生異常表達(dá)和活性改變，在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)量也較在正常組織中升高。結(jié)合本文的分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果，似乎預(yù)測(cè)了迷迭香酸可通過抑制MMP-9和AKT1的表達(dá)進(jìn)而治療子宮內(nèi)膜癌。

為了研究交集靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和通路，本文進(jìn)行了GO生物學(xué)功能富集分析和KEGG通路富集分析，主要涉及的重要通路有糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、查加斯病、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。在這些通路中，IL-17信號(hào)通路能夠增加癌細(xì)胞的惡性程度，其中IL-17A能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤遷移[11-12]，IL-17可以激活NFκB和MAPK通路，NF-κB和MAPK均是IL-17發(fā)揮其促炎癥作用的靶基因，可促進(jìn)腫瘤導(dǎo)致的炎性反應(yīng)[13]。TNF信號(hào)通路是維持組織穩(wěn)態(tài)和防止炎癥病理的關(guān)鍵，與細(xì)胞的存活和凋亡相關(guān)，TNF是激活NF-κB的主要細(xì)胞因子，同時(shí)，TNF也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[14]。Toll樣受體家族是一組結(jié)構(gòu)高度保守的模式識(shí)別受體，通過識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抵御病原體入侵，能夠通過直接和間接的方式影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制免疫應(yīng)答的功能[15-16]，Toll樣受體2家族在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，則提示患者惡性程度高，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)概率大[17-18]。本研究為迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的潛在可行性提供了依據(jù)。

綜上所述，本研究利用數(shù)據(jù)庫對(duì)迷迭香酸治療子宮內(nèi)膜癌的潛在靶點(diǎn)和作用通路進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可能具有治療子宮內(nèi)膜癌的潛在價(jià)值，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了思路和依據(jù)。